シングルによってデコンボリューションされた免疫細胞のダイナミクス

Nature Communications volume 14、記事番号: 2285 (2023) この記事を引用

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14 オルトメトリック

メトリクスの詳細

正常温機械灌流 (NMP) は、革新的な臓器保存技術として登場しました。ドナー臓器の免疫細胞の組成と、NMP 中のその動的変化についての理解を深めていくことが不可欠です。我々は、肝臓NMP中の免疫細胞（部分）集団、細胞輸送、およびサイトカイン放出の包括的な特性評価を目的としました。移植前、NMP中、および移植後のヒトドナー肝臓の単一細胞トランスクリプトームプロファイリングでは、豊富なCXCケモカイン受容体1+/2+（CXCR1+/CXCR2+）好中球が示され、NMP中に有意に減少しました。これと並行して、灌流液中では好中球が優勢な乗客白血球の大量流出が起こります。 NMP中、好中球は炎症促進状態から老化/慢性活性化/疲弊した表現型に移行する一方、抗炎症性/寛容原性単球/マクロファージが増加します。本明細書では、炎症反応に寄与する可能性がある、肝臓NMP中の免疫細胞レパートリーの動態、表現型免疫細胞のシフト、および好中球の優勢について説明する。私たちの発見は、将来の免疫介入研究を開始するためのリソースとして役立つ可能性があります。

肝移植（LT）は、末期肝疾患に対する唯一の根治的な治療法です1、2、3。需要が供給をはるかに上回っているため、臓器不足が依然として大きな制限要因となっている。拡張基準ドナー (ECD) からの臓器の利用率の向上と併せて、より優れた保存技術の必要性が、正常温機械灌流 (NMP) の開発に取り入れられました。これにより、臓器は、37 °C の生理学的条件に近い状態で、栄養と抗生物質が補充された酸素化ヘパリン添加赤血球濃縮物で閉鎖滅菌システム内で継続的に灌流されます。 NMP は、体外保存中の臓器の品質と機能の包括的な評価を可能にし、体外臓器の再調整、治療、修復のプラットフォームとして機能する可能性があります 2,4,5,6,7,8,9。

何百もの臓器の機械灌流が成功しており、短期的な結果は、NMP が臓器廃棄率を低下させ、移植に適した臓器の適切な選択に役立つ可能性があることを示しています 4,10,11,12。しかし、大まかな臓器機能は容易に測定可能ですが、NMP 中の臓器とその組織に存在する白血球の免疫状態についてはほとんどわかっていません。 ex vivo の肺および腎臓の灌流の実験研究では、多数のパッセンジャー白血球が動員され、灌流液中に血管外に遊出するため、移植片の免疫原性に影響を与えます 13,14。乗客白血球の灌流液への動員を示唆するデータは、肝臓 NMP15 にも発表されています。炎症能力と肝臓固有免疫細胞の規模を考慮すると、肝臓免疫細胞の状態に対する NMP の影響と NMP 中のその動態をより深く理解することが非常に重要です。ここでは、全トランスクリプトーム単一細胞 RNA シーケンス (scRNASeq) 技術 16 を使用した詳細なパッセンジャー白血球マッピングは、肝臓 NMP 中の炎症回路を含む分子機構の理解を大幅に高めると考えられました。近年、scRNASeq 研究は、虚血/再灌流傷害 (IRI) を含むさまざまな条件下でのヒト肝臓の細胞の不均一性を評価することを目的としています 17、18、19、20、21、22、23、24。 NMP の前後で 8 つのヒトドナー肝臓の詳細な連続免疫細胞マッピングを適用して、免疫調節性サイトカイン/ケモカインの供給源と単細胞レベルでの免疫活性化の動態を具体的に調査しました。私たちは肝生検における多重免疫蛍光 (IF) 染色によって所見を検証し、視覚化しました。対応する免疫細胞の動員は、26 回のヒト肝臓 NMP 中に収集された連続灌流液サンプルの表現型解析、およびサイトカインのプロファイリングと定量化によって特徴付けられました。

この研究では、深層免疫細胞マッピングにより、ヒトのドナー肝臓における好中球の優位性が示されており、好中球は肝臓の NMP 中に早期に灌流液に動員されます。肝臓免疫細胞レパートリーの表現型と動態を、対応する細胞間コミュニケーションパターンとともに評価することにより、正常温度で機械灌流された肝臓の免疫学の理解が深まります。

研究対象集団全体の概要を表 1 に示します (個々のデータは補足表 1 に示します)。研究肝臓と分析に関する詳細情報は、図 1 のワークフロースキームとして提供されています。NMP を適用する決定は、次の兆候の 1 つまたは組み合わせに基づいて行われました：（D）臓器の質が低いと推定される、（R）手術が複雑なレシピエント、および/または (L) ロジスティクス (ソースデータファイル)。 NMP 時間は、評価に必要な時間と手術の目標時間によって異なります 2、4、25。 NMP 時間の中央値は 19.13 時間 (h) (四分位範囲 (IQR) 11.56 ～ 21.64) でした。アスパラギン酸トランスアミナーゼ (AST) とアラニントランスアミナーゼ (ALT) のピークの中央値は 6410 U/l (IQR 2422 ～ 13,696) と 3194 U/l (IQR 1402 ～ 7791) で、6 時間の乳酸レベルの中央値は 12 mmol/l ( IQR 18–180)。肝臓を移植するか廃棄するかの決定は、以前に定義された灌流パラメータに基づいて行われました2、4、25。事前に定義された基準（方法を参照）に従って、NMP 後に 24 個の肝臓が移植されましたが、生理学的 pH 値を維持できないこと、乳酸分解が不十分であること、および AST/ALT 灌流液レベルが高いため、10 個の肝臓が移植を拒否されました。

合計 34 個のドナー肝臓がこの研究に含まれ、NMP の対象となりましたが、34 個のドナー肝臓のうち 8 個が scRNASeq 用にランダムに選択され、34 個のうち 26 個が灌流液サンプリング用にランダムに選択されました。さらに、タンパク質レベルの所見を評価および検証するために、34 肝臓すべてから組織サンプルが収集されました。臓器のサンプリング時点、分析、ドナーおよび移植ステータスに関する情報が提供されます。 FFPE 新鮮凍結パラフィン包埋、NMP 定温機械灌流、RP 再灌流、IF 免疫蛍光、IHC 免疫組織化学、脳死後の DBD ドナー、循環死後の DCD ドナー。

末期肝疾患（MELD）のレシピエントモデルの中央値とリスクバランス（BAR）スコアは14（IQR 11～18）と7（IQR 7～10）でした。レシピエントの年齢中央値は 60 歳 (IQR 55 ～ 68) でした。集中治療室（ICU）と総在院日数の中央値は5日（IQR 3～9）、21日（IQR 15～30）でした。 9 人の患者 (37%) が早期同種移植片機能不全 (EAD) を発症しました。 Clavien-Dindo グレード >3 の合併症は 11 人 (46%) の患者で発生しました。患者3人は真菌性敗血症で死亡し、1人はクロストリジウム・ディフィシル敗血症で、1人は胆管敗血症で死亡した。死亡打ち切り移植片生存率は 100% でした (表 2)。

最初のステップとして、scRNASeq プロファイリングを使用して、NMP を受けた 8 つのドナー肝臓の全体的な免疫細胞レパートリーを、NMP 前 (T0)、NMP 終了時 (T1)、および再灌流後 (T2) で特徴付けました (図 2A)。教師なしクラスタリングを使用して、最も関連性の高い細胞集団に注釈を付けました (図 2B)。私たちの分析は、肝炎症細胞を含む実質を構成するすべての肝細胞タイプの細胞組成と遺伝子発現の動態を記述します。データセット全体が利用可能であり、遺伝子発現の表現型と構成細胞の動態は興味深く関連性があるが、この研究の焦点は、ヒトドナー肝臓の体外灌流中の肝炎症細胞の動的な変化であった。

scRNASeq ワークフローの概要。取得された scRNASeq データセットにおける上皮細胞 (KRT18)、白血球 (PTPRC/CD45)、および内皮細胞 (SPARC) の割合が示されています。 B 118,448 個の単一セルの均一多様体近似および射影 (UMAP) プロット。セルの種類ごとに色分けされています。 C 8 人の患者の肝臓組織における相対的な細胞型組成。 D UMAP プロット。示された細胞型特異的マーカー遺伝子 (赤い矢印) の発現について色分けされています。 E 細胞型特異的マーカーの遺伝子発現レベル。 F scRNASeq 対フローサイトメトリーによって測定された肝組織内の白血球集団の割合。 G UMAP プロットは、細胞あたりの転写産物の数によって色付けされます。カラースケールは 20,000 でクリップされます。 H 細胞タイプごとの転写物数の箱ひげ図。値は患者ごとの平均を示します (n = 8)。中心線は中央値を示します。ボックスはデータの四分位範囲 (IQR) を表し、ひげは IQR の 1.5 倍以内の最も極端なデータポイントまで伸びています。

マーカー遺伝子を分析して、好中球 (FCGR3B)、単球/マクロファージ (CD68)、CD3+ T 細胞 (CD3E)、CD4+ T 細胞 (CD4)、CD8+ T 細胞 (CD8A)、制御性 T 細胞 (Treg) などの特定の細胞タイプに注釈を付けました。）（FOXP3）、ナチュラルキラー（NK）細胞（NKG7）、樹状細胞（FLT3）、前駆細胞（CD24）、B細胞（CD79A）、形質細胞（JCHAIN）、肝細胞（ALB）、内皮細胞（FLT1）、および胆管細胞（KRT19;図2D、E、補足図2）。堅牢なデータ解釈を保証するために、特徴的な細胞型を定義するためのマーカー遺伝子シグネチャに焦点を当てました。これにより、アノテーションプロセス (ソースデータファイル) の有効性が裏付けられました。

患者間である程度の不均一性が見られましたが、全体的な細胞組成は臓器間で同等でした（図2C、補足図3A、B）。好中球は全患者において主要な免疫細胞クラスターとして同定され（48.7%、57,564 細胞）、単球/マクロファージ系統は肝臓内で全体的に 2 番目に優勢な免疫細胞タイプとして同定されました（7.75%、18,682 細胞、図 2C、個人）。患者はソースデータファイルを参照してください)。一致して、免疫組織化学（IHC）は、肝臓組織の主要な常在白血球集団として好中球（CD15）および単球/マクロファージ（CD68）を示しました（補足図4）。 scRNASeq によって同定された白血球の割合は、対応するサンプルのフローサイトメトリーによって検証されました (図 2F)。

好中球は、例外的に低いmRNA含有量、したがって細胞あたり検出される転写物の数が比較的少ないことによって定義されました（図2G、H。追加のQCメトリクスは補足図3D、Eに示されています）。我々は最近、他の scRNASeq プラットフォームと比較して、BD Rhapsody ワークフローが細胞あたり非常に多くの mRNA 分子を捕捉するため、mRNA 含有量の低い細胞を描写するのに特に適している可能性があることを実証しました 26。したがって、1 細胞あたり捕捉される mRNA 分子の数が比較的多いため、mRNA 含有量が比較的低い好中球が scRNASeq データセットで同定されました (図 2H; 平均 nCount_RNA: 4106; 好中球の平均 nCount_RNA: 2050)。データセット。

要約すると、免疫細胞アトラスは、NMP の終了前、および再灌流後に 8 人のヒトドナー肝臓から収集された合計 21 個の生検標本に基づいています。私たちの分析では細胞組成をデコンボリューションし、これまで認識されていなかった好中球を単一細胞解像度で描写します。

肝免疫細胞状況に対する NMP の影響を調査するために、NMP 前 (T0) と NMP 終了後 (T1) に採取された連続生検サンプルの scRNASeq プロファイルの違いを評価しました (図 3A; 各細胞の細胞数) T0 と T1 のタイプはソースデータファイルに表示されます)。

細胞タイプごとに色分けされた、90,404 個の単一細胞 (T0 および T1 サンプルのみ) の UMAP プロット。 B NMP 前 (T0) および NMP 終了時 (T1) の肝臓組織における相対的な細胞型組成。 C 90,404 個の単一細胞の UMAP プロット。時点ごとに色分けされています [NMP 前 (T0) と終了時 (T1)]。単球/マクロファージ (1) および好中球 (2) クラスターが強調表示されます。 D 単独および汎サイトケラチンとともに提示された免疫マーカーの多重免疫蛍光画像、および NMP 前 (T0) および NMP 終了時 (T1) の表現型マップ。表現型マップは InForm で生成されました。各色の点は細胞の表現型を表し、黒い点は表現型が不明な他の細胞を表します。画像は 20 倍の倍率で表示されます (スケールバー: 100 μm)。 E、F 10 人の患者における個々の免疫マーカーの細胞密度 (細胞数/mm2)。上のパネル E は、NMP 前 (T0) および NMP 終了時 (T1) の個々の肝臓の値を示しています。下のパネル F は、各バイオマーカーの統計分析を示しています (n = 10、対応のある t 検定、両側、平均 ± SEM、**p = 0.0097)。

最も驚くべきことに、好中球の割合は灌流時間とともに減少しましたが、単球/マクロファージ、T細胞、およびB細胞の割合はNMP中にわずかしか変化しませんでした(図3B)。さらに 10 個の肝臓から採取した生検でさまざまな免疫細胞をマルチプレックス IF 染色することで、次の発見が確認されました。NMP は、単球/マクロファージ (CD68)、T 細胞 (CD3 および CD8)、および B 細胞 (CD20) の数と分布に顕著な影響を与えませんでした。一方、好中球（CD15）の絶対数は時間の経過とともに有意に減少しました（p < 0.001）（図3D〜F）。ただし、好中球は灌流期間全体を通じて顕著なままでした（図3B、D〜F）。

興味深いことに、NMPは好中球および単球/マクロファージのトランスクリプトームプロファイルの顕著な変化を誘導しました（図3C）。一方、細胞ストレスレベルは、検出されたミトコンドリア転写物の相対量（%MT、補足図5A）および遺伝子発現によって定義されます。一連の重要なストレスおよびアポトーシス関連転写産物のレベル（補足図5B）は、NMPによって顕著な影響を受けませんでした。要約すると、NMP は灌流時間の経過とともに肝臓好中球の量と割合を大幅に減少させますが、他の主要な免疫細胞タイプは顕著な影響を受けません。

次に、最大の肝内免疫細胞集団を構成する好中球のトランスクリプトームサインを評価し、遺伝子発現と表現型の変化に対する NMP の影響をより詳細に調査するために注釈を付けた部分集団を評価しました。図４Ａは、ＩＦＩＴＭ２、ＣＳＦ３Ｒ、ＦＰＲ１、ＦＣＧＲ３Ｂ、ＶＮＮ２、Ｇ０Ｓ２、ＣＸＣＲ２、およびＳＯＤ２を含む、好中球における既知のマーカー遺伝子を示す。 CXCR2は好中球クラスターで主に発現するため、特に興味深いものです（図4B、C;個々の患者および生検データを補足図6Aに示します）。 CXCR1についても同様の発現パターンが観察されました（図4C、補足図6B）。したがって、NMP は CXCR2 および CXCR1 遺伝子発現レベルの大幅な低下をもたらしました (図 4D)。我々は、NMP前およびNMP終了後の10個の肝臓の多重IF染色により、好中球上の対応するCXCケモカイン受容体(CXCR)2タンパク質の発現を検証した(図4E)。好中球数の減少（図 3D ～ F）と同様に、好中球上の CXCR2 タンパク質発現は NMP 中に大幅に減少しました（図 4F）。同様に、CXCR4 mRNA 発現は NMP 中に顕著に上昇し、消耗した/老化した好中球の割合が増加する可能性があることを示しました (図 4D)27。

A 個々の細胞タイプにおける好中球特異的遺伝子の遺伝子発現レベル。 B 個々の細胞タイプにおける CXCR2 遺伝子発現レベル。各ドットは患者の平均値を表します (n = 8)。 C 41,177 個の好中球の UMAP プロット。時点および CXCR2、CXCR1、および CXCR4 遺伝子発現レベルによって色分けされています。 D NMP 前 (T0) および NMP 終了時 (T1) の好中球における CXCR2、CXCR1、および CXCR4 遺伝子発現レベル。各ドットは患者の平均値を表します (n = 7)。誤検出率 (FDR) は、DESeq2 による擬似バルク分析を使用して決定されました。 E CXCR2 および CD15 pre (T0) NMP の免疫蛍光染色。画像は 20 倍の倍率で表示されます (スケールバー: 100 μm、n = 10、各サンプルについて 4 つの代表的な画像が撮影されました)。 F NMP 前 (T0) および NMP 終了時 (T1) の CXCR2+ 細胞の細胞密度 (細胞数/mm2)。上のグラフは個々の肝臓の値を示し、下のグラフはカラム統計分析 (n = 10、対応のある t 検定、両側、平均 ± SEM、*p = 0.02) です。 G NMP 前 (T0) および NMP 終了時 (T1) の好中球における CXCL8 遺伝子発現レベル。各ドットは患者の平均値を表します (n = 7)。誤検出率 (FDR) は、DESeq2 による擬似バルク分析を使用して決定されました。 H 90,404 個の単一細胞 (T0 および T1 サンプルのみ) の UMAP プロット。CXCL8 遺伝子発現によって色分けされています。単球/マクロファージ (1) および好中球 (2) クラスターが強調表示されます。 I 好中球から他の細胞型への異なるシグナル伝達。上のパネル: T0 対 T1 で差次的に発現された好中球のリガンド (擬似バルクに対する両側 DESeq2 Wald 検定、p 値は誤検出率 (FDR) に調整されました)。赤色は、T0 と比較して T1 での上方制御を示します。下のパネル: それぞれの受容体と細胞タイプ別の発現。ドットのサイズと色は、それぞれ受容体と遺伝子発現を発現している細胞の割合を表し、全患者の平均値を示します。ドットは、それぞれの細胞型の少なくとも 10% で発現される受容体についてのみ示されています。すべての箱ひげ図で、中心線は中央値を示します。ボックスはデータの四分位範囲 (IQR) を表し、ひげは IQR の 1.5 倍以内の最も極端なデータポイントまで伸びています。

好中球の遺伝子サインに対するNMPの影響は、差次的に発現された遺伝子（DEG）分析を通じてさらに評価されました（T0対T1;上位に制御され選択されたDEGは補足図6Cに示されています）。我々は、NMP中の好中球クラスターにおけるCXCL8/IL-8の有意な上方制御を特定した(図4G;ソースデータファイル)。 CXCL8 は、CXCR2 と CXCR1 の両方に対する同族の炎症促進性リガンドであり、好中球の活性化と好中球細胞外トラップ (NET) の形成を媒介します 28。好中球および程度は低いが単球/マクロファージがCXCL8産生の主な供給源であった(図4H)。一致して、CellChat29を使用した細胞間通信ネットワークの分析では、NMP中のCXCL8-CXCR1 / CXCR2シグナル伝達を介した自己分泌好中球活性化（図4I）および単球/マクロファージ誘発好中球活性化（下記参照）がそれぞれ示されました。

NMP末端の好中球の転写プロファイルは、我々が最近同定し、非小細胞肺がん腫瘍組織における老化/慢性的に活性化/枯渇した好中球として特徴付けられた表現型に似ていた(図5A:CXCR1、CXCR2、PTGS2、 SELL、およびCXCR4、CD83、CCRL2、CCL3、CCL4、ICAM1)の発現上昇。 VEGFAのアップレギュレーション（図5A、補足図6C）および好中球から内皮細胞へのVEGFA-KDR1 / FLT1細胞コミュニケーションパターンの上昇（図4I）は、NMP中に組織修復が血管再形成を介して誘導されることを示唆しています。損傷した組織。

A 個々の患者における NMP 前 (T0) および NMP 終了時 (T1) の好中球における選択されたマーカー遺伝子の発現 (n = 7)。中心線は中央値を示します。ボックスはデータの四分位範囲 (IQR) を表し、ひげは IQR の 1.5 倍以内の最も極端なデータポイントまで伸びています。擬似バルクに対する両側 DESeq2 Wald 検定。p 値は、独立仮説重み付け (IHW) を使用して誤検出率 (FDR) に調整されます。 B サブクラスター (N0、N1、N2、N3) ごとに色付けされた好中球の UMAP。 C 好中球サブクラスターにおける選択されたマーカー遺伝子の発現。 D NMP 前 (T0) および NMP 終了時 (T1) の好中球サブクラスターの相対組成。 E DoRothEA を使用して計算された、T0 と T1 における細胞タイプごとの転写因子活性 (TF) 活性の差。赤は、T0 と比較して T1 における TF レギュロンの上方制御を示します。 p 値は両側 t 検定を使用して決定され、誤検出率 (FDR) について調整されました。 t 統計は、decoupler-py で実装されている多変量線形モデルを使用して計算されました。 F T0 対 T1 における細胞タイプごとの選択された「ホールマーク」遺伝子セットの遺伝子セット過剰表現分析 (ORA)。小さい p 値は、遺伝子セット内の遺伝子の中で、偶然に予想されるよりも多くの遺伝子が差次的に発現していることを示します (片側フィッシャーの直接確率検定)。

次に、教師なしのライデンクラスター化によって好中球を4つのサブセットに分離しました（N0〜N3、図5B、上位の制御遺伝子はソースデータファイルに示されています）。これはすべての患者によって支持されました（補足データ6D）。 N0 クラスターは、炎症部位への好中球遊走を誘導する炎症誘発性遺伝子 (S100A12、S100A8、S100A9、MMP8、MMP9)30、31、32、NETosis 補因子 PADI433、およびそれに関与する遺伝子の発現によって特徴づけられました。インテグリン媒介細胞接着 (ITGAM、ITGA1、ITGA6)。したがって、N0 クラスターは、炎症促進性の高度に活性化された好中球表現型を表します。 N1 クラスターは N0 クラスターにかなり似ていましたが、ITGA4 およびマクロファージの組織修復機能を調節する TAFA4 の発現上昇を示しました 34 (図 5C、ソースデータファイル)。注目すべきことに、炎症誘発性のN0およびN1好中球の割合はNMPの過程で明らかに減少したが、N2好中球は著しく増加した(図5D)。 N2 クラスターは、上記の老化/慢性活性化/消耗表現型 (CXCR4、CD83、CCRL2、CCL3、CCL4、ICAM1、VEGFA) に似ていました。 N2 好中球は、慢性的に活性化された腫瘍関連好中球で最近同定されたマーカーである OLR1 も発現しました (図 5C、ソースデータファイル)。一致して、転写因子（TF）活性分析により、NMPがOLR135の直接転写調節因子であるPPARGの有意な誘導を引き起こすことが明らかになった（図5E）。 N3 クラスターは、細胞アポトーシスの開始を示すミトコンドリア遺伝子 (MT-CYB、MT-ND4、MT-ATP6) の高発現を示し、また、急性期応答 (SAA1、SAA2) およびインターフェロンシグナル伝達 (IFIT1、SAA2) に関与する遺伝子も示しました。 IFIT2)36 (図 5C、ソースデータファイル)。特に、N3 好中球は NMP 中に減少しました (図 5D)。

我々の発見を総合すると、NMPはヒト肝臓において好中球を活性化された炎症促進状態から老化/慢性的に活性化/疲弊した表現型に移行させることを示しており、これはNMP中に好中球によって引き起こされる急性炎症プロセスが減弱することを示唆している。

異なる細胞集団の発現プロファイルと、細胞のプロセスおよび経路を示す選択された遺伝子セットとの間の関連性を評価するために、遺伝子セット濃縮分析（GSEA）を実行しました（図5F）。炎症反応、アポトーシス、腫瘍抑制因子活性に関与するいくつかの経路が好中球で認識されました。単球/マクロファージは、補体エフェクター機能に関係する経路をシグナル伝達します。補体活性化は慢性炎症プロセスに関与していますが、免疫抑制性微小環境もサポートし、組織修復だけでなく血管新生も誘導します 37。これらの発見は、抗炎症作用、組織治癒作用、再生作用を持つ単球/マクロファージへの移行を示唆しています。

単球/マクロファージは肝臓の炎症反応において重要な調節機能を持っているため、我々はそれらの表現型をより詳細に評価しました。 CD68 細胞表面マーカー発現を特徴とする単球/マクロファージは、NMP 中にトランスクリプトームプロファイルが大幅に変化しました（図 3C、6A、補足図 7A、図 6B: 単球/マクロファージ細胞 CST3、CTSB、MS4A7、MARCH1 の既知のマーカー遺伝子）、CD68、MAFB、CD163、VCAN、および CSF1R)38,39。単球/マクロファージにおけるCXCL8の発現上昇（図4H）、および炎症誘発性ケモカインCCL2およびCCL3の有意な誘導（NMP前およびNMP終了時の単球/マクロファージ細胞の選択されたトップDEGを補足図7Cに示す） NMP 中に、単球/マクロファージの表現型が炎症促進状態に移行することを示しています。細胞間コミュニケーション分析により、さまざまな免疫細胞上で発現されるその同族受容体（例えば、CD44）に対するSPP1（オステオポンチン）シグナル伝達の強力な上昇が示された（図6G）。オステポンチンは、免疫細胞の遊走、極性化、活性化を調節するため、急性および慢性の炎症に影響を与えます40。炎症促進性刺激とは対照的に、NMP は単球/マクロファージの炎症状態を特徴付ける重要な遺伝子 (LYZ、FCN1、VCAN、HLA-DRA、S100A8、S100A9、S100A12、MNDA、CSTA、CD74) の発現を減少させ、発現レベルを上昇させました。寛容原性表現型に関連するマーカーの数（CD163、MARCO、HMOX1、VSIG4、NSMAF、CTSB、VMO1、図6Bおよび補足図7C）17。伝統的に、マクロファージは炎症性または免疫調節性のいずれかに分類されます41。 VSIG4 遺伝子発現は、免疫介在性肝損傷時の T 細胞およびナチュラルキラー T (NKT) 細胞の寛容を媒介します 42。同様に、マウスにおける HMOX1 (ヘモキシゲナーゼ) のノックダウンは肝臓の炎症を引き起こします 43。マクパーランドら。は、MARCO の発現が主に非炎症性ヒトマクロファージで上昇していることを実証しました 17。

13,720 個の単球/マクロファージの UMAP プロット。時点 [NMP 前 (T0) および NMP 終了時 (T1)] および相対的な CD68 遺伝子発現レベルごとに色分けされています。 B NMP前（T0）およびNMP終了後（T1）の単球/マクロファージにおける炎症マーカー（LYZ、FCN1、VCAN、HLA-DRA）および寛容原性マーカー（CD163、MARCO、HMOX1、およびVSIG4）の遺伝子発現レベル。各ドットは患者の平均値を表します (n = 7)。誤検出率 (FDR) は、DESeq2 による擬似バルク分析を使用して決定されました。中心線は中央値を示します。ボックスはデータの四分位範囲 (IQR) を表し、ひげは IQR の 1.5 倍以内の最も極端なデータポイントまで伸びています。 C 単球/マクロファージ特異的遺伝子の遺伝子発現レベル。 D サブクラスター (M0、M1、M2、M3) によって色付けされた単球/マクロファージの UMAP。 E 単球/マクロファージサブクラスターにおける選択されたマーカー遺伝子の発現。 F NMP 前 (T0) および NMP 終了時 (T1) の単球/マクロファージサブクラスターの相対組成。 G 単球/マクロファージから他の細胞型への異なるシグナル伝達。上のパネル: T0 対 T1 で差次的に発現された単球/マクロファージのリガンド (擬似バルクに対する両側 DESeq2 Wald 検定、p 値は誤検出率 (FDR) に調整されました)。赤色は、T0 と比較して T1 での上方制御を示します。下のパネル: それぞれの受容体と細胞タイプ別の発現。ドットのサイズと色は、それぞれ受容体と遺伝子発現を発現している細胞の割合を表し、全患者の平均値を示します。ドットは、それぞれの細胞型の少なくとも 10% で発現される受容体についてのみ示されています。上方制御されたリガンドのみが示されています。下方制御された相互作用のリストは、ソースデータファイルで入手できます。

NMP中の単球/マクロファージの可塑性をさらに詳しく分析するために、教師なしライデンクラスタリングを実行し、すべての肝臓で4つの特徴的なサブセット（M0からM3）を特定しました（図6D、図6E、上位に制御されているマーカー遺伝子はソースデータファイルに示されています）。 (補足図7D)。 M0 サブクラスターはいくつかの炎症促進性遺伝子の高い発現を示し、このクラスターが炎症性単球/マクロファージ (LYZ、VCAN、S100A8、S100A9、S100A12、MNDA) を表すことを示唆しています。 DEG分析と一致して、炎症誘発性M0単球/マクロファージの割合はNMP中に大幅に減少した(図6F)。 M1 サブクラスターは、頻繁に報告されている C1Q+ マクロファージ集団 (C1QB、MRC1、HLA-DOA、FOLR2) と驚くほど類似していました 44。観察された補体経路関連遺伝子（C1QB、C1QC、AXL）の上方制御は、エフェロサイトーシスを介した損傷組織の除去におけるM1サブクラスターの潜在的な役割を示唆しています45、46。対照的に、M2 クラスターは、非古典的単球 (CDKN1C、CYFIP2) に匹敵する遺伝子発現プロファイルを示しました 47,48。また、組織に構成的にホーミングする単球を定義し、組織修復と組織修復に寄与するマーカーである CX3CR1 の高い発現も示しました。創傷治癒49． M1 および M2 サブクラスターは NMP 中に顕著に変化しませんでしたが、M3 クラスターは大幅に増加しました (図 6F)。このサブクラスターは、主に選択的に活性化された (「M2 様」) マクロファージに関連するマーカーの発現によって特徴付けられました。 M2 様マクロファージは細胞増殖と血管新生を誘導しますが、細胞残骸の除去と組織修復の促進にも関与しています (PLAU、CXCL5、CFS1、FPR3、SPP1、CTSL、IL4I1、HS3ST1、SERPINB2、SLC7A11)50、51、52、53。 54、55、56、57、58、59、60、61。 M3 サブクラスターは、細胞外マトリックス形成と創傷修復機構に関与する FN1 (フィブロネクチン) も発現しました 62。注目すべきことに、単球/マクロファージにおける細胞-2-細胞コミュニケーション分析は、例えば胆管細胞上で発現されるその同族受容体ITGB1に対するFN1シグナル伝達の上昇を示した(図6G)。さらに、M3 クラスターでは多数の抗炎症マーカーが同定されました。PHLDA1、MMP19、FABP5、NRP1、NRP2、RASGRP3、DHRS9、MT1H マーカーは、炎症誘発性サイトカイン産生の潜在的な減衰を示しています 63,64,65,66,67 、68、69、70、71。

要約すると、我々のデータは、炎症促進性メーカーの誘導と単球/マクロファージの全体的な炎症促進性表現型には、細胞増殖に寄与する抗炎症性および寛容原性 (「M2 様」) 細胞サブタイプの誘導が伴うことを示しました。血管新生、創傷治癒、組織修復。

NMP 中の組織常駐免疫細胞の単一細胞の状況を定義した後、次に灌流液コンパートメントに焦点を当てました。したがって、我々はさらに 26 の肝臓の灌流液における免疫細胞の動態を調査し、これらの観察結果を NMP 中の肝臓内免疫細胞の変化と関連付けました (図 7A)。細胞生存率は一連の灌流液サンプルで確認されました (図 7B)。 NMP 開始後 1 時間という早さで、CD45+ 白血球の絶対数の急速な増加が観察されました (2537/μl [2003, 3215])。主要なサブセットは、CD45+HLA-DRlow 顆粒球 (1947/μl [1510, 2511])、CD45+CD3+ T 細胞 (203/μl [157, 263])、CD45+CD56+ NK 細胞 (99/μl [68, 143]) でした。 ])、CD45+CD19+ B 細胞 (52/μl [38, 71])、および CD45+CD14+ 単球/マクロファージ (37/μl [26, 54]) (図 7C、D)。回帰分析により、すべての白血球サブタイプの灌流時間にわたる絶対細胞数の統計的に有意な変化が示されました。 CD45 + CD19 + B細胞およびCD45 + CD14 + 単球/マクロファージは6時間でピークに達しましたが、NMPの6時間を超えるとすべてのサブセットで総白血球数の減少が観察されました（図7E、F、補足表2）。

NMP 灌流液分析ワークフローと適用されたメソッド。 B フローサイトメトリー前の細胞生存率試験 (n = 3 前、1 時間の NMP 時および NMP 終了時) では、灌流液中の非生存細胞の割合が非常にわずかしか示されませんでした。 C 総循環灌流液中の主な免疫細胞サブタイプの絶対 CD45+ 白血球量 (平均 ± SEM)、および D 1 時間 NMP での組成。 E、F NMP 中の総 CD45+ 白血球と主要なサブタイプの動的変化。 G 灌流時間にわたる CD3+ T 細胞サブタイプ (割合) の動的変化。グラフは限界効果を示しています。値は線形回帰分析を使用して推定されます。 p 値は、時間の経過に伴う変化を指します。線形モデルを使用して計算された最小二乗平均が 95% CI とともに表示されます。 N = 26 の生物学的に独立したサンプル。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。 NK細胞ナチュラルキラー細胞、NKT細胞ナチュラルキラーT細胞、MAIT細胞粘膜関連不変T細胞。

scRNASeq 免疫細胞アトラスおよび肝臓組織の IF 染色で同定された好中球の割合は、NMP 時間の経過とともに減少しましたが、灌流液では高い絶対数の好中球が見つかりました。これらの対応する所見は、好中球が灌流液中へ迅速に移動することを示している。これは、程度は低いものの、他の炎症細胞にも当てはまります。これらの細胞の変化は、基本的な量的パターンおよび動態に関して、肝生検で得られた免疫細胞のパターンと一致します。要約すると、主に好中球の灌流液への急速かつ顕著な移動が見出された。

さらに、フローサイトメトリーを使用して、5 つの連続灌流液サンプルにおける主要な免疫細胞集団のサブタイプとその動的変化を特徴付けました。 1 時間の NMP では、灌流液中の CD45+CD3+ T 細胞サブセットは 48% [42, 54] CD3+CD4+ T ヘルパー細胞を含み、44% [37, 50] は CD3+CD8+ 細胞傷害性 T 細胞でした。両方のサブセットの割合は、灌流時間にわたって CD4+ T ヘルパー細胞を優先して大幅に変化しました。 CD3 + CD56 + NKT 細胞および CD3 + T 細胞受容体 (TCR) Vα2.2 + CD161 + 粘膜関連不変 T (MAIT) 細胞は、灌流時間にわたる関連する動態を示さず、T 細胞全体のごく一部にすぎませんでした (図 7G)。 CD3+CD4+メモリーT細胞の割合は灌流時間とともに大きく変化しましたが(図8A)、CD3+CD8+メモリーT細胞は安定したままでした(図8B)。 CD4+CD25+FoxP3+Treg は 1 時間の時点で T 細胞集団の 2.32% [1.58, 3.28] を占めました。注目すべきことに、それらの割合は灌流時間の経過とともに大幅に増加し、24時間のNMPで4.71％[3.29、6.59]となった（図8C）。 CD45+CD56+ NK 細胞はほとんどが CD56dimCD16+ (94.21% [96.11, 91.58]) であり、経時的に大きな変化はありませんでした (図 8D)。CD14+CD16+ 単球/マクロファージの中で、CD14+CD64+CD163+ クッパー細胞は灌流液中にわずかな割合しか含まれていませんでした。 1 時間では (5.56% [3.39, 8.78])、しかし、長期間の灌流に比例して強い増加が観察されました (24 時間の NMP: 11.86% [7.05, 19.52]、図 8E)。 -DRlow 顆粒球)、CD15+CD16+ 好中球が優勢であり (93.45%% [88.90, 96.30])、非常に少数の Siglec-CD8+CD16- 好酸球 (0.38% [0.20, 0.59])、および CD16+CD123+ 好塩基球 (0.23% [ 1 時間の NMP で 0.13, 0.34])、それらの割合は時間の経過とともに変化しませんでした (図 8F). 樹状細胞は、NMP 中に顕著な動態を示さず、総白血球のごく一部 (1 時間の NMP で 0.86% [0.53, 1.27]) のみを占めました。 (図8G、補足表3)。

NMP 中のさまざまな時点で収集された灌流液 (NMP を受けた肝臓 n = 26) を、A CD4+ T 細胞、B CD8+ T 細胞、C 調節特性を持つ CD3+ T 細胞のサブタイプ、D CD56+ NK の割合の動的な変化について評価しました。細胞、E CD45+CD14+ 単球/マクロファージ、F CD45+HLA-DRlow 顆粒球、および G 樹状細胞。グラフは限界効果を示しています。値は線形回帰分析を使用して推定されます。 p 値は、時間の経過に伴う変化を指します。線形モデルを使用して計算された最小二乗平均が 95% CI とともに表示されます。 N = 26 の生物学的に独立したサンプル。 H 8 人のドナー肝臓における scRNASeq によって評価した、NMP 前 (T0) および NMP 終了時 (T1) の単球/マクロファージおよび好中球における示された炎症促進因子 (インターロイキン/ケモカイン) の遺伝子発現レベル。 I 単球/マクロファージおよび好中球によって産生され、26 人のドナー肝臓の灌流時間にわたって収集された灌流液サンプル中のタンパク質レベルで上昇した、評価された炎症誘発性インターロイキン/ケモカインのスペクトル。（J）移植された肝臓（n = 6）および廃棄された肝臓（n = 2）におけるscRNASeqによって評価された、NMP前（T0）およびNMP終了後（T1）の単球/マクロファージおよび好中球におけるIL-6およびTNFの遺伝子発現レベル。中心線は中央値を示します。ボックスはデータの四分位範囲 (IQR) を表し、ひげは IQR の 1.5 倍以内の最も極端なデータポイントまで伸びています。さらに、NMP を施した 26 人のドナー肝臓の灌流液について、NMP の 1、4、6、12、24 時間における IL-6 および TNF レベルと、移植された肝臓 (n = 18) と廃棄された肝臓 (n = 8) の違いを測定しました。肝臓を計算しました。グラフは限界効果を示しています。値は線形回帰分析を使用して推定されます。 p 値は、時間の経過に伴う変化を指します。線形モデルを使用して計算された最小二乗平均が 95% CI とともに表示されます。 N = 26 の生物学的に独立したサンプル。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。 Tcm: セントラルメモリー T 細胞、Tem: エフェクターメモリー T 細胞、Temra: CD45RA を再発現するエフェクターメモリー細胞 T 細胞、DN T 細胞: ダブルネガティブ T 細胞 (CD4- および CD8-)、NK 細胞ナチュラルキラー細胞、DC樹状細胞。

これらのデータは、NMP 中の循環灌流液への広範囲の白血球スペクトルの動員を強調しています。 24 時間の NMP 期間中に採取された連続サンプルの分析により、明確な移行動態が明らかになりました。多くの免疫細胞サブタイプの灌流液への移動は非常に急速に見られましたが、Treg 細胞とクッパー細胞の動員と放出は、NMP 後 12 時間という早さで増加しました。

次に、免疫細胞のインターロイキン/ケモカイン遺伝子発現レベルと連続灌流液サンプルのタンパク質レベルを調査しました。単球/マクロファージは炎症促進性IL1B、IL18、CXCL8、CCL2、CCL3、CCL4、およびTNFの発現を増加させましたが、好中球は主にCXCL8を発現し、程度は低いですがIL1BおよびCXCL1を発現しました（図8H）。 IL10などの抗炎症マーカーの発現は、単球/マクロファージで誘導されました（図8H）72。

トランスクリプトームデータセットと一致して、単球/マクロファージおよび好中球で発現される炎症誘発性サイトカインも時間の経過とともに灌流液中で増加し、これは肝臓微小環境および灌流液への転写およびタンパク質放出の増加を示しています (図 8I)。補足図8は、灌流時間にわたるタンパク質レベルでのすべてのサイトカイン/ケモカインの動態を示しています(それぞれの値は補足表4に示されています)。 T細胞とNK細胞のトランスクリプトームサインには軽度の変化のみが見つかりました（補足図9）。

ドナーの種類（脳死後の提供（DBD）対 DCD）および移植の適合性（移植肝臓対廃棄肝臓）がタンパク質サイトカイン動態に及ぼす影響をより詳細に評価しました。ほとんどの灌流液サイトカインは、すべてのグループで灌流時間を延長すると増加しました。 IL-6 濃度は、DBD 移植片と比較して、DCD 移植片の灌流液中で最も有意に上昇しました (p = 0.05、補足図 10、補足表 5)。この現象は、廃棄肝臓と移植肝臓を比較した場合にも観察されました（p = 0.032、図8J、補足図10、補足表6）。一致して、本発明者らは、転写レベルで単球/マクロファージにおけるIL6発現の上昇を見出し、この細胞型が少なくとも実質的にIL-6産生に寄与していることを示した(図8J)。 IL-6に加えて、廃棄肝臓と移植肝臓を比較した場合、灌流液中の腫瘍壊死因子（TNF）も有意に増加しました（p = 0.012、図8J、補足図11、補足表6）。

我々のデータを総合すると、肝臓NMP中の免疫反応はドナーの種類、「低品質」（移植に適さない）移植片と「許容可能な」移植片の間で異なることが示唆されます。

ヒト臓器の ex vivo NMP は、臓器の保存を改善および延長するための急速に進歩した臨床ツールです。さらに、移植前に機能を評価できることは、満たされていないニーズに対処し、再灌流中の分子事象を解明する独自の可能性を提供します。この技術は、将来の標的を絞った生体外臓器治療の基盤となる可能性もあります。肝臓には、重要な免疫調節機能を持ち、適切な肝機能にとって中心的な役割を果たす免疫細胞が大量に含まれているため 73、我々は、ヒトのドナー肝臓および NMP 中の灌流液における免疫細胞 (サブ) 集団の特徴を詳細に解析し、灌流液のサイトカインを評価しました。深層免疫細胞マッピングにより、ドナーの肝臓では好中球が優勢であることが示され、好中球はNMP中に即座に灌流液に動員されます。好中球は、活性化された炎症促進状態から老化/慢性的に活性化/疲弊した表現型に移行し、単球/マクロファージは組織修復に必須の抗炎症/寛容原性特性を発現します。

この研究に含まれた 34 人のヒトドナー肝臓の NMP には問題はなく、臓器の完全性に影響を与えることなく組織および灌流液サンプルを繰り返し評価することができました。好中球は、8 つのドナー肝臓に対して実行された、最も一般的な免疫細胞集団ベースの sc トランスクリプトームとして同定されました。マルチプレックス IF および IHC 分析により、CD15+ 好中球が主要な肝免疫細胞タイプであり、臓器全体に斑点状に分布していることが裏付けられました。興味深いことに、我々の知る限り、好中球系統は、これまでに公開されたヒト肝臓の scRNASeq データセットでは完全に無視されています 17、18、19、22、23、24、74。この矛盾は、生物学的現象によるものではなく、方法論的な落とし穴に起因する可能性が最も高くなります。好中球は非常に寿命が短く75、組織の解離や分別に対して特に敏感な極めて脆弱な細胞タイプであるため、これらの細胞を保存するには、組織の解離から細胞溶解までの迅速かつ穏やかなワークフローが不可欠です。さらに、好中球は非常に少量の mRNA 分子を発現するため 76、scRNASeq データでの好中球の回収が妨げられます。私たちは最近、液滴ベースの 10x Chromium シーケンスプラットフォームで生成されたデータセットでは好中球を適切に検出できず、他のプラットフォームでは非常に限られた範囲でしか検出できないことを実証しました。しかし、この研究で適用されたマイクロウェルベースの scRNASeq プラットフォームでは、細胞あたり比較的多数の mRNA 分子を捕捉できるため、mRNA 含有量の低い細胞の回収率が向上します 26。 8 つの肝臓の scRNASeq により膨大なデータセットが生成されましたが、肝臓の質における違いの総数と範囲には依然として限界があります。この研究にはECD肝臓が含まれていますが、各臓器は移植片の品質や既存の疾患/損傷が異なる可能性があり、この取り組みにおける個人間の変動を完全に把握することは不可能です。

当社の NMP 灌流液で観察される好中球駆動の炎症回路は、さまざまな急性および慢性の肝臓病変を促進することが示されています 77。好中球と同様に、単球/マクロファージは肝臓内の組織恒常性と免疫活性化の重要な調節因子です78。我々はここで、NMPがヒト肝臓において高度に活性化された好中球から老化/慢性的に活性化/疲弊した表現型への移行を引き起こすという証拠を提供する。具体的には、NMP による好中球の活性化は、炎症促進性微環境に寄与する IL-8/CXCR1/2 軸の誘導によって反映されます。これにより、NET 形成が誘発され、肝臓 IRI が悪化する可能性があります 79。これらの発見は、好中球活性化中のCXCR1/2阻害がNMP中の過剰な炎症反応を制限するのに役立つ可能性があることを示唆しています。

NMP 中の単球/マクロファージの動態は、炎症促進性または抗炎症性の表現型として明確に記述することはできませんが、むしろ応答および反応答のシーケンスを示します。これは、炎症誘発性単球/マクロファージが減少する一方で、細胞増殖、血管新生、創傷治癒および組織修復に関与する抗炎症性および寛容原性(「M2様」)サブタイプがNMP中に有意に増加することを示すサブクラスター分析にも反映されています。それぞれ。

臓器の炎症プロファイル/免疫細胞レパートリーに対する NMP (および一般的な機械灌流) の影響についての現在の理解は限られています 80。ラットの肝臓では、損傷関連分子パターン (DAMP) が機械灌流中に組織損傷を誘発することが示されています 81。同様のモデルでは、NMP が広範な炎症性遺伝子発現サインと肝臓常駐免疫細胞の活性化を誘導することが示されました。 IL-10 およびトランスフォーミング成長因子 (TGF)-β による治療により、このモデルでは炎症が緩和されました 82。ヒトの肝臓で行われた研究では、NMP は炎症を抑制し、移植片の再生を促進しました 83。

Lee らによる 6 時間の NMP で 6 つの肝臓で観察されたサイトカイン発現の亢進と一致して、我々は灌流液中で炎症誘発性サイトカインと抗炎症性サイトカインの両方の発現を発見しました 83。灌流液中のインターロイキン/ケモカインの蓄積は、肝実質中の好中球および単球/マクロファージのトランスクリプトーム変化と一致します。 DCD 移植片および廃棄肝臓の灌流液中の IL-6 の有意な増加は、これらの臓器におけるより顕著な炎症反応を示している可能性があります。実際、Ohman ら 84 は最近、NMP に曝露した場合の低質/機能低下肝臓における免疫応答は機能している移植片とは異なることを報告したが、両群で法外に高い灌流液レベルの IL-6 が報告された。したがって、私たちの観察は、臨床的重要性を決定する前にさらなる注意を払う必要があります。

白血球、特に好中球の動員と灌流液への移行は非常に迅速でした。これは、NMP 中のブタの肺および腎臓からのデータと一致しています。これらの研究では、過剰な遊走は、急性拒絶反応率の低下を伴う免疫原性の低下にも関連していました 13,14。ここでは、灌流免疫細胞について詳細に説明し、26 個のヒト肝臓のコホートにおける最大 24 時間の灌流における動的変化についての洞察を提供します。私たちの研究では、NMP の終了時にかなりの数の細胞が灌流液中に存在していましたが、ほとんどの細胞タイプが灌流時間とともに減少したことは、この影響が軽減されたことを示しているようです。あるいは、循環している免疫細胞が肝臓に戻ることもあります。組織と灌流液の間の免疫細胞のより詳細な追跡研究により、この動的なプロセスがより詳細に解明されるでしょう。

さらに、例えば、白血球の活発な動員および／または白血球の除去によるこのプロセスの調節は、ＮＭＰ中の肝臓の抗原性／炎症性負荷を軽減する可能性がある。しかし、循環免疫細胞のサブセットは組織再生、組織リモデリング、治癒および寛容誘導にも関与しているため、無差別な中止は理想的ではない可能性があります80。一例として、NMP 中に単球/マクロファージにおける抗炎症性「M2 様」表現型が強力に誘導されることを示します。これは組織の修復およびリモデリングのメカニズムを促進する可能性があるため、炎症性および組織に損傷を与える可能性のある免疫細胞サブセットをより標的を絞って除去することを提案します。ここで我々は、炎症誘発性好中球の選択的標的化（例えば、CXCR2アンタゴニストによる）が、ex vivo灌流中の標的免疫調節への第一歩となる可能性があることを示唆する。さらに、NMP 中の炎症促進性サイトカインの濾過も有益である可能性があります。ヒト腎臓灌流試験からの最初の結果は、移植片機能の遅延に関連する遺伝子発現サインに対するプラスの効果を示しました85。

結論として、我々の包括的な分析は、トランスクリプトームおよびタンパク質レベルでのヒト肝臓のNMP中の肝臓免疫細胞レパートリーの動態を強調しています。詳細な免疫細胞マッピングにより、ヒトのドナー肝臓では好中球が優勢であることが明らかになりました。これらの細胞は、他のさまざまな免疫細胞集団とともに、肝臓の NMP 中に急速に大部分が灌流液中に遊走します。灌流が長引くと、免疫細胞の活性化状態は、炎症促進性の表現型から、疲弊するが再生性の表現型へと分岐します。私たちの発見と対応するデータセットは、将来の介入研究の基礎として機能し、NMPおよびLT中の標的免疫調節による炎症を軽減するさらなる道を開く可能性があります。

この研究は、関連するすべての倫理規制に準拠しています。この研究は、インスブルック医科大学の治験審査委員会（プロトコル #1175/2018）によって承認されました。すべての参加者から事前にインフォームドコンセントを得ました。

2019年4月から2021年7月までに、NMPを受けた合計34人のドナー肝臓が登録された。すべての臓器は、NMP 後に移植する目的で受け入れられました。肝臓は、回収中にウィスコンシン大学 (UW、n = 14) またはヒスチジン-トリプトファン-ケトグルタル酸 (HTK、n = 20) 溶液を使用してフラッシュされ、氷上の同じ保存液を使用して標準的な冷蔵条件に従って出荷されました。私たちの施設への輸送後（バック・トゥ・ベースのコンセプト）、肝臓は、現地のプロトコールに従ってOrganOx metraデバイスを使用して灌流されました2。私たちのセンターに到着したら、移植片を2000mlのHTKで洗い流して、残っている血球をすべて除去しました。次に、肝臓を NMP 用に外科的に準備し、灌流装置に接続しました。 NMP 灌流液は、メーカーのプロトコールに従って、3 ユニットの O 型白血球除去 (30 Gy 照射) 濃縮赤血球 (RBC、各 300 ml)、500 ml のゲロフシン (B. Braun) および添加剤から構成されました。現地の基準によれば、白血球除去赤血球バッグの 1 パック単位には最大 1 × 106 個の白血球が含まれます。私たちの施設で最近確立された灌流液分析のスキームを含む、NMP の標準化されたプロトコルが適用されました 2。これには、ICU での臓器の観察と管理を伴う学際的なアプローチが含まれます。臓器を移植するか廃棄するかの決定は、乳酸の減少、pHの維持、およびグルコース消費に基づいて行われました。 2 時間の NMP 後の重炭酸ナトリウム補給なしでの生理的 pH 値 (7.3 ～ 7.45) の維持、および乳酸の生理的レベル (≤18 mg/dl) への急速な減少と維持は、良好な臓器機能を示す重要な要素と考えられます。これに加えて、AST、ALT、および乳酸デヒドロゲナーゼの異常に高いレベル (>10,000 U/l) およびこれらのパラメーターの急激な傾きは、警告信号と考えられます。この研究に含まれた肝臓レシピエントは、初回移植または再移植の対象としてリストされている18歳以上の成人でした。

NMP を受けた 34 のドナー肝臓のうち、ランダムに選択された 8 つの研究肝臓で scRNASeq 分析が実行されました。したがって、楔状肝生検サンプルを、３つの個別の時点、すなわち、ＮＭＰ前（Ｔ０）、ＮＭＰ終了時（Ｔ１）、および移植する場合は再灌流後（Ｔ２）で収集した。フローサイトメトリーおよびLuminex分析による細胞定量化/表現型解析およびサイトカイン評価のために、別の26の研究肝臓の連続灌流液サンプルをNMPの1、4、6、12時間およびNMP終了時に収集した。サンプル数、組織/灌流液の採取、時点および分析の種類に関する詳細情報を図 1に示します。

NMP の前 (T0) と NMP の終了 (T1)、および再灌流後 (T2) に採取された肝臓生検 (n = 8 肝臓) を、氷上ですぐに小片 (<1 mm) に切り刻み、その後 10 分間酵素消化しました。 BD TuDoR 解離試薬 (BD Biosciences) を使用して、撹拌しながら 37 °C で反応させます。単一細胞懸濁液を 100 μM セルストレーナーで濾過し、製造元のプロトコールに従って BD Pharm Lyse (BD Biosciences) 溶解溶液を使用して赤血球を除去しました。細胞生存率は、Calcein-AM (Thermo Fisher Scientific) および Draq7 (BD Biosciences) を使用して、BD Rhapsody scRNASeq プラットフォーム (BD Biosciences) で測定しました。

新たに単離した単一細胞懸濁液を直ちに処理し (組織解離から細胞溶解まで 30 分未満)、BD Rhapsody 単一細胞 WTA プロトコールに従って全トランスクリプトーム増幅 (WTA) シーケンシングライブラリーを生成しました。私たちは、白血球の動態を包括的にデコンボリューションする目的で、マイクロウェルベースの BD Rhapsody scRNASeq プラットフォームを選択しました。これは、mRNA 含有量の低い細胞 (好中球など) の描写が可能であり、40 μm を超える大きな細胞 (肝細胞) の損失につながる可能性があるためです。ビード排除現象によるものです。得られたシーケンシングライブラリの品質は、4200 TapeStation システム (Agilent) および Qubit dsDNA HS (高感度) アッセイキット (Thermo Fisher Scientific) を使用して検証されました。シーケンスは、S1 試薬キット v1.5 (200 サイクル、68 bp インデックスリード 1; Illumina) を使用して、NovaSeq 6000 System プラットフォーム (Illumina) で計算されたシーケンス深度 50,000 リード/セルで実行されました。

取得した FastQ シーケンスファイルのバイオインフォマティクス前処理は、BD Rhapsody WTA Analysis Pipeline アプリを使用して、クラウドベースの Seven Bridges プラットフォーム環境 (Seven Bridges Genomics) 経由で実行されました。データは、scverse ツールでさらに処理するために AnnData86 にロードされました。品質管理は scanpy87 を使用して実行され、(1) 250 ～ 8000 個の検出遺伝子、(2) 1000 ～ 100,000 個の転写物、(3) <30% のミトコンドリア転写物を含む細胞のみを保持しました。 4000 個の最も可変性の高い遺伝子 (HVG) は、scanpy の high_variable_genes 関数を使用して、オプション Flavor = "seurat_v3" およびバッチ_key = "patient" を使用して選択されました。細胞トランスクリプトームは、scVI88、89 を使用してバッチ補正された低次元潜在空間に埋め込まれ、各サンプルを別個のバッチとして処理しました。ダブレットは、scvi-tools89 で実装されている SOLO90 を使用して特定され、削除されました。近傍グラフと均一多様体近似および射影 (UMAP) 埋め込み 91 は、scVI 潜在空間に基づいて計算されました。細胞タイプは、ライデンアルゴリズム92および既知のマーカー遺伝子を用いた教師なしクラスタリングに基づいて注釈が付けられました。

我々は、差次的発現テストのために擬似バルクサンプルに対して DESeq293 を使用しました。これは、良好に機能し、誤った発見を適切に修正することが実証されています94。各細胞タイプおよび患者について、decoupler-py95 を使用して細胞の少なくとも 5% で発現する各遺伝子の転写物数を合計しました。 1000 カウント未満または 10 個の細胞からなる擬似バルクサンプルは廃棄しました。 P 値は、独立仮説重み付け (IHW) を使用して複数の仮説検定用に調整されました96。単球/マクロファージおよび好中球サブクラスターのマーカー遺伝子は、Becht et al.91 で定義されているように、受信者オペレーター特性曲線下面積 (AUROC) および疑似バルクサンプルの log2 倍率変化メトリクスを使用して決定されました。マーカー遺伝子は、AUROC > 0.7 および log2 倍率変化が好中球では > 1、単球/マクロファージでは > 2 を持つものとして定義されました。

decoupler-py95 で実装されている多変量線形モデルを使用して、DoROthEA97 で転写因子解析を実行しました。最も高い信頼レベル「A」および「B」を持つレギュロンのみを使用しました。 DESeq2 解析からの倍率変化を入力として使用しました。さらに、decoupler-py で実装されている過剰表現検定 (ORA、つまりフィッシャーの直接確率検定) を使用して遺伝子セット濃縮分析を実行しました。異なる細胞タイプ間の DE 比較では、疑似バルクサンプルの数が異なるため、統計的検出力が異なります。細胞型ごとに差次的に発現される遺伝子の数が異なることによるバイアスを回避するために、各細胞型で最も差次的に発現する 182 個を過剰表現テストに使用しました。これは、すべての細胞型にわたる DE 遺伝子の数の中央値に相当します。誤検出率 (FDR) < 0.01 および |log2 倍変化 | > 1.

我々は、omnipathdb29 から取得した CellChat データベース 29 を使用して、時点間の細胞間通信の違いを調査しました。オリジナルの CellChatDB アルゴリズムは、細胞タイプ間の違いを見つけるように設計されています。一方、私たちの研究では、患者を生物学的複製として使用し、時点間の違いに興味がありました。したがって、対象の細胞タイプごとに、CellChatDB で有意に差次的に発現されるリガンドのリストを検討しました。これらの差次的に発現されるシグナル伝達分子のそれぞれおよび各細胞型について、その変化によって潜在的に影響を受ける相互作用パートナーを、特定の細胞型の細胞の少なくとも 10% で発現する相互作用パートナーとして決定しました。差次的に発現されるシグナル伝達分子は、上記のように DESeq2 を使用して決定されました。シグナル伝達分子を発現する細胞の割合は、患者ごとの細胞数の違いによる偏りを避けるために、患者ごとの割合の平均として計算されました。

NMP の投与前 (T0) と終了時 (T1) に採取した肝生検 (26 肝臓からランダムに選択した n = 10) を 4% パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋しました。 Opal 7-Color Automated Immunohistochemistry Kit (カタログ: NEL821001KT、Akoya Biosciences) を使用して、4 μm 切片で多重 IF 染色を実行しました。 CD15、CD8、CD68、CD3、CD20、サイトケラチン (パネル 1) および CD15、CXCR2 (パネル 2) に対する抗体を含む免疫マーカーのパネルを構成しました。マーカーを順次適用し、それぞれのオパール蛍光団と組み合わせました（使用した抗体は補足表7に記載されています）。染色は自動システム (BOND-RX; Leica Biosystems) を使用して実行されました。細胞核を視覚化するために、組織を 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (スペクトル DAPI、Akoya Biosciences) で染色しました。スライドは、Mantra 2 Quantitative Pathology Workstation (Akoya Biosciences) および Mantra Snap ソフトウェア v1.0.4 を使用してスキャンされました。各組織から 5 ～ 8 枚の代表的な画像を分析のために取得しました。スペクトル分離、マルチスペクトル画像解析、および細胞表現型解析は、inForm Tissue Analysis Software v2.4.10 (Akoya Biosciences) を使用して実行されました。免疫細胞密度を定量化し、「細胞数/mm2」として示します。対応のある t 検定を使用して、2 つのグループ間の差異を評価しました。グループ化分析では、データポイントは平均値 ± 平均値の標準誤差 (SEM) の散布図上に表示されます。分析は GraphPad Prism v6.0 を使用して実行されました。

NMP 前 (T0) および NMP 終了後 (T1) の肝生検から単離された細胞を、事前に滴定された濃度の 19 抗体のカクテル (補足表 8) で染色し、洗浄して 7-AAD を添加した後、測定しました。 FACSymphony A5 フローサイトメーターで。データは、FlowJo v10.7 ソフトウェアを使用して分析されました (ゲート戦略の詳細については、補足図 12 を参照)。

NMP (5 ml) を行った 26 肝臓の連続灌流液サンプルを、NMP の 1、4、6、12 時間および終了時に Cyto-Check BCT チューブ (Streck) に収集しました。これらのチューブで細胞を即時固定することにより、細胞の形態と表面抗原の発現が維持され、サンプルを室温で少なくとも 5 日間保存できます。私たちの研究では、物流を容易にするために固定チューブが選択されました。各染色には 500 μl の灌流液を使用しました。最初に、500 μl の灌流液の赤血球を RBC 溶解バッファー (Thermo Scientific、eBioscience) で溶解しました。 Fc Blocking Reagents (BD Bioscience) でブロッキングした後、細胞を、補足表 9 に記載の抗体を含むさまざまな組み合わせの抗体マスターミックスとともにインキュベートしました。 FoxP3 細胞内染色の場合、Foxp3/転写因子染色バッファーセット ( Thermo Scientific、ebioscience）を使用し、FoxP3 抗体とインキュベートする前に正常ラット血清（Thermo Scientific、ebioscience）とインキュベートしました。絶対細胞数の定量化には、メーカーのプロトコールに従って BD Trucount Tubes (BD Bioscience) を使用し、LSRFortessa フローサイトメーター (Becton Dickinson and Company) を使用して分析しました。ダブレットの排除は、前方および側方の散乱領域、高さ、および幅 (FSC-および SSC-A/-H/-W) をプロットすることによって達成されました。データは FlowJo v6.2 (Tree Star) で分析されました。ゲート戦略は補足図に示されています。 13～20。細胞生存率試験のために、NMP の開始時、1 時間後、および NMP の終了時に灌流液を収集しました (n = 5)。赤血球は RBC 溶解バッファーで溶解し、白血球はトリパンブルーで染色しました。最低 150 細胞/サンプルを二重に計数し、結果を平均して死細胞/生細胞の割合を計算しました。

NMP を行った 26 個の肝臓の連続灌流液サンプルを遠心分離し、500 μl の血清を -80 °C で凍結しました。サイトカイン/ケモカインタンパク質レベルは、Luminex MAGPIX 装置 (Luminex Corporation) の Cytokine&Chemokine 34-Plex Human ProcartaPlex パネル 1A (EPX340-12167-901、Thermo Fisher Scientific) を使用して測定し、xPonent 4.2 Rev.2 ソフトウェア (Luminex Corporation) によって分析しました。メーカーのプロトコルに従ってください。サイトカインプロファイリングは、ドナータイプ（DBD肝臓対DCD肝臓）および移植ステータス（移植肝臓対廃棄肝臓）に照らして読み取られた。

灌流液データは、絶対値または割合 (%)、推定平均値 ± 標準偏差 (SD) および 95% 信頼区間 (CI) として表されます。細胞組成のダイナミクスには、反復測定のための線形混合効果モデル (LMM) が使用されました。正に歪んだ分布を考慮して、対数変換が実行されました。一元配置分散分析を使用して、全体的な時間経過の灌流を考慮して差異を評価しました。生物学的複製によって集められた疑似バルクサンプルに対して DESeq2 を使用して、単一細胞差次的遺伝子発現解析を実行しました。分析は、R 統計ソフトウェア (v4.0.3、Team RC、R Foundation for Statistical Computing) を使用して実行されました98。グラフは、GraphPad Prism 9.1.0 (216) を使用して完成されました。非ターゲット分析 (DE 遺伝子、TF、遺伝子セット) の P 値は FDR 調整されました。統計検定の有意水準と詳細は図のキャプションに示されています。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究の結果を裏付ける配列データ (すべての図) は、NCBI GEO アクセッション GSE216584 を通じて入手できます。他のすべてのデータは、記事とその補足ファイルで、または要求に応じて対応する著者から入手できます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

データ分析を再現するためのソースコードは、https://github.com/icbi-lab/nmp-liver から入手できます。コードの実行に必要な処理済みの入力データとコンテナ化されたソフトウェアの依存関係は、zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7249006) から入手できます。

Cardini, B. et al. 肝臓の質を評価するための新しいツールとしてのライブ共焦点イメージング: マウスモデルからの洞察。移植 104、2528–2537 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Cardini, B. et al. 肝移植における正常温度機械灌流による肝臓の長期保存とモニタリングの臨床実装。移植 104、1917 ～ 1928 年 (2020)。

論文 PubMed Google Scholar

フォーダー、M.ら。急速に変化する肝移植分野におけるエンドポイントと結果分析を更新する必要性。移植 106、938–949 (2021)。

論文 PubMed Google Scholar

ナスララ、D. et al. 肝移植における正常体温保存のランダム化試験。ネイチャー 557、50–56 (2018)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Ceresa, CDL、Nasralla, D.、Coussios, CC & Friend, PJ 肝移植における正常温機械灌流の事例。肝臓移植。 24、269–275 (2018)。

論文 PubMed Google Scholar

Ceresa, CDL、Nasralla, D. & Jassem, W. 肝臓の正常温度保存装置: 最先端技術。カー。トランスプリット議員 5、104–110 (2018)。

論文 PubMed Google Scholar

Ravikumar、他。 ex vivo 正常温機械保存後の肝移植: 第 1 相 (ファーストインマン) 臨床試験。午前。 J. Transpl. 16、1779–1787 (2016)。

記事 CAS Google Scholar

Ravikumar、R.、Leuvenink、H.、友人、PJ 正常肝臓の保存: 新しいパラダイム? トランスプリット Int 28、690–699 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

マージェンタル、H.ら。正常温機械灌流による生存率試験後の廃棄肝臓の移植。ナット。共通。 2939 年 11 月 (2020 年)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

マージェンタル、H.ら。正常温機械灌流を使用して高リスク肝臓の原発性機能不全を予測するための機能評価のための臨床基準の開発。肝臓移植。 24、1453–1469 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Weissenbacher, A. et al. 灌流酵素と血小板は、正常温度で保存された肝臓の移植後の早期の同種移植片の機能不全を示します。移植 106、792–805 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

フォーダー、M.ら。静的冷蔵保存と肝臓の正常温機械灌流との比較、および移植後の虚血型胆管病変に対する効果: 傾向スコアを照合した研究。 Br. Ｊ．Ｓｕｒｇ． 108、1082–1089 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ストーン、JP et al. 正常温灌流は、腎移植前にドナー由来の白血球の動員と除去を誘導します。腎臓内科議員 1、230–239 (2016)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ストーン、JP et al. ex vivo肺灌流を使用したパッセンジャー白血球の除去によるドナー肺の免疫原性の変化。午前。 J. Transpl. 16、33–43 (2016)。

記事 CAS Google Scholar

ジャセム、W.ら。正常温機械灌流 (NMP) は、肝臓の炎症誘発性反応を抑制し、再生を促進します。肝臓学 70、682–695 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Potter, SS 発生、生理学、疾患の研究のための単一細胞 RNA シーケンス。ナット。ネフロル牧師。 14、479–492 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

マックパーランド、SA et al. ヒト肝臓の単一細胞 RNA 配列決定により、異なる肝臓内マクロファージ集団が明らかになります。ナット。共通。 9、4383 (2018)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao、J.ら。単一細胞 RNA 配列決定により、ヒトの肝臓常駐免疫細胞の不均一性が明らかになります。セル発見。 6、22 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

アイザラニ、N.ら。ヒト肝細胞アトラスは、不均一性と上皮前駆細胞を明らかにします。ネイチャー 572、199–204 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

シーガル、JMら。ヒト胎児肝臓の単一細胞分析により、肝胆道ハイブリッド前駆細胞の転写プロファイルが捕捉されます。ナット。共通。 10、3350 (2019)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

タンブリーニ、BAJ 他ヒトの慢性肝疾患は、肝臓リンパ内皮細胞の拡大と分化を引き起こします。フロントイミュノール。 10、1036 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ワン、L.ら。肝臓移植中の移植片虚血再灌流傷害を単一細胞解像度で解決します。細胞死障害 12, 589 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ラマチャンドラン、P. et al. ヒト肝硬変の線維化ニッチを単細胞レベルで解決します。ネイチャー 575、512–518 (2019)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Payen、VL et al. ヒト肝臓の単細胞 RNA 配列決定により、肝星細胞の不均一性が明らかになりました。 JHEP 議員 3、100278 (2021)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ブラル、M.ら。ヒトの正常温体外肝灌流に関するカナダの単一施設の予備的経験：臨床試験の結果。午前。 J. Transpl. 17、1071–1080 (2017)。

記事 CAS Google Scholar

サルチャー、S.ら。高解像度の単一細胞アトラスは、非小細胞肺がんにおける組織内在性好中球の多様性と可塑性を明らかにします。 Cancer Cell 40、1503–1520 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Metzemaekers, M.、Gouwy, M. & Proost, P. 健康と病気における好中球化学誘引物質受容体：両刃の剣。細胞。モル。イムノール。 17、433–450 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ha, H.、Debnath, B. & Neamati, N. がんおよび炎症性疾患における CXCL8-CXCR1/2 軸の役割。 Theranostics 7、1543–1588 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ジン、Ｓ． CellChatを使用した細胞間通信の推論と分析。ナット。共通。 1088 年 12 月 (2021 年)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rouleau, P. et al. カルシウム結合タンパク質 S100A12 は、ヒトの炎症性関節炎で見られるものと同様の濃度で、マウスの骨髄からの好中球の接着、遊走、放出を誘導します。クリン。イムノール。 107、46–54 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ryckman, C.、Vandal, K.、Rouleau, P.、Talbot, M. & Tessier, PA S100 の炎症促進活性: タンパク質 S100A8、S100A9、および S100A8/A9 は好中球の走化性と接着を誘導します。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 170、3233–3242 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Heissig, B. et al. 組織再生における好中球由来のマトリックスメタロプロテイナーゼ-9の役割。ヒストル。ヒストパトール。 25、765–770 (2010)。

CAS PubMed Google Scholar

レシュナー、M.ら。 PAD4 媒介ヒストンの過剰シトルリン化は、ヘテロクロマチンの脱凝縮とクロマチンのアンフォールディングを誘導して、好中球の細胞外トラップ様構造を形成します。フロント。イムノール。 3、307 (2012)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Hoeffel、G. et al. 感覚ニューロン由来のTAFA4はマクロファージの組織修復機能を促進します。 Nature 594、94–99 (2021)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Chui、PC、Guan、HP、Lehrke、M. & Lazar、MA PPARガンマは、酸化型 LDL 受容体 1 を介して脂肪細胞のコレステロール代謝を調節します。 J. Clin. 調査します。 115、2244–2256 (2005)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ローザ、BA 他 IFN シグナル伝達と好中球脱顆粒の転写サインは、SARS-CoV-2 感染中に誘導されます。共通。バイオル。 4、290（2021）。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hartung, HP & Hadding, U. マクロファージによる補体の合成と補体活性化によるそれらの機能の調節。スプリング。セミン。イムノパトール。 6、283–326 (1983)。

記事 CAS Google Scholar

Sica, A.、Invernizzi, P. & Mantovani, A. 肝臓の恒常性と病理におけるマクロファージの可塑性と分極化。肝臓学 59、2034–2042 (2014)。

論文 PubMed Google Scholar

Koyama, Y. & Brenner, DA 肝臓の炎症と線維症。Ｊ．クリン．調査します。 127、55–64 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

飯田哲也、我妻和夫、平山大輔、中瀬博司オステオポンチンは炎症性胃腸疾患や肝臓疾患における細胞アポトーシスの敵か味方か？内部。Ｊ．Ｍｏｌ．科学。 19、7 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

マレー、PJ & ウィン、TA マクロファージサブセットの保護機能と病原性機能。ナット。イミュノール牧師。 11、723–737 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jung, K. et al. 肝臓T細胞およびナチュラルキラーT細胞の寛容を誘導することによる、免疫介在性肝損傷時にクッパー細胞上に発現するVセットおよび免疫グロブリンドメイン含有4の保護的役割。肝臓学 56、1838–1848 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ryter、SW ヘムオキシゲナーゼ-1: 心血管、肺、および関連する代謝障害における抗炎症エフェクター。酸化防止剤 (バーゼル) 11, 555 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Revel, M.、Sautes-Fridman, C.、Fridman, WH & Roumenina, LT C1q+ マクロファージ: 癌進行の乗客または推進者。トレンドキャンサー 8、517–526 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Khedraki, R.、Noguchi, H. & Baldwin, WM 移植における C1q の見方のバランスをとる: 有益な側面と有害な側面の考察。フロント。イムノール。 13、873479 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

藤森哲ほか Axl 受容体チロシンキナーゼは、炎症を起こした肺におけるマクロファージの機能を識別します。粘膜免疫。 8、1021–1030 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

カペロス、TS 他主要な慢性炎症性疾患におけるヒト単球のサブセットと表現型。フロント。イムノール。 2035年（2019年）10月。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ウォン、KLら。遺伝子発現プロファイリングにより、古典的、中間的、および非古典的ヒト単球サブセットの決定的な特徴が明らかになります。血液 118、e16–e31 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Al Sadoun, H. 正常および糖尿病の創傷治癒および治療介入におけるマクロファージの表現型。セル 11、2430 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Danø、K. et al. プラスミノーゲンの活性化とがん。血栓。ヘモスト。 93、676–681 (2005)。

論文 PubMed Google Scholar

Hu, B.、Fan, H.、Lv, X.、Chen, S. & Shao, Z. 癌患者における CXCL5 発現の予後的重要性: メタ分析。がん細胞内部 18、68 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

van den Boorn, JG & Hartmann, G. マクロファージコロニー刺激因子 Fc 結合体による治療的組織再生。モル。それで。 22、1577–1579 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Qi、J.ら。乳がんの免疫微小環境における標的療法のための独自のバイオマーカーとしての FPR3 の同定。フロント。薬局。 11、593247 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Dong, B.、Wu, C.、Huang, L. & Qi, Y. 肺腺癌における初期リンパ節転移の潜在的なバイオマーカーとしてのマクロファージ関連 SPP1。フロント。セル開発バイオル。 9、739358 (2021)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

メンゼル、K.ら。炎症性腸疾患マクロファージにおけるカテプシン B、L、および D、および in vivo でのカテプシン阻害の潜在的な治療効果。クリン。経験値イムノール。 146、169–180 (2006)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sierra-Filardi、E. et al. CCL2はGM-CSFおよびM-CSFによるマクロファージの極性化を形成する：CCL2/CCR2依存性遺伝子発現プロファイルの同定。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 192、3858–3867 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Yue, Y. et al. IL4I1 は、L-トリプトファンとアルギニンの枯渇および IL-10 産生を介して T 細胞の活性化を阻害できる、M2 マクロファージ極性化の新規調節因子です。 PLoS ONE 10、e0142979 (2015)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Swart, M. & Troeberg, L. ヘパラン硫酸プロテオグリカンおよび生合成酵素のマクロファージ発現に対する極性化と慢性炎症の影響。Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．サイトケム。 67、9–27 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アダムソン、SE et al. 骨髄細胞における Dab2 (無効ホモログ 2) の欠損は、肝臓の炎症と LDLR (低密度リポタンパク質受容体) のアテローム性動脈硬化斑を悪化させる - ヌルマウスの簡単な報告。動脈硬化。血栓。バスク。バイオル。 38、1020–1029 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao、A.ら。 SerpinB2 は、腸管線虫感染に対する Th2 免疫に重要です。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 190、5779–5787 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Wang, G.、Shen, G.、Jiang, X.、Chen, Z. & ying, T. 創傷治癒モデルにおける副炎症の評価。経験値それで。医学。 20、655–661 (2020)。

PubMed PubMed Central Google Scholar

タリク、AA et al. 古典的および選択的に活性化されたヒトマクロファージの表現型、機能、および可塑性の特徴。午前。Ｊ．レスピア．細胞モル。バイオル。 53、676–688 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Peng, H. et al. PHLDA1 は、Tollip との相互作用により、TLR4 によって誘発される炎症誘発性サイトカインの産生を抑制します。フロント。イムノール。 13、731500 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brauer、R. et al. MMP-19欠損は、自然免疫細胞の機能の欠陥により大腸炎の悪化を引き起こします。粘膜免疫。 9、974–985 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Moore, SM、Holt, VV、Malpass, LR、Hines, IN & Wheeler, MD 脂肪酸結合タンパク質 5 は、マウスのマクロファージの抗炎症反応を制限します。モル。イムノール。 67、265–275 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ウィルソン、AM et al. 脂肪組織マクロファージにおけるニューロピリン-1の発現は、肥満やメタボリックシンドロームから保護します。科学。イムノール。 3、eaan4626 (2018)。

論文 PubMed Google Scholar

ロイ、S.ら。マクロファージ由来のニューロピリン-2は、新たな腫瘍促進機能を示します。がん研究所 78、5600–5617 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tang, S. et al. RasGRP3は、Rap1 small GTPaseを活性化することにより、マクロファージにおけるToll様受容体誘発性炎症反応を制限します。ナット。共通。 5、4657 (2014)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

リケルメ、P. et al. DHRS9 は、ヒト調節マクロファージの安定したマーカーです。移植 101、2731–2738 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Dai, H.、Wang, L.、Li, L.、Huang, Z. & Ye, L. メタロチオネイン 1: 炎症性疾患に新たなスポットライトを当てる。フロント。イムノール。 12、739918 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Saade, M.、Araujo de Souza, G.、Scavone, C.、木下 PF 炎症における GPNMB の役割。フロント。イムノール。改訂版 12、674739 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu, L.、ying, W.、Sun, R.、Wei, H. & Tian, Z. クッパー細胞由来の IL-10 は、B 型肝炎ウイルス持続マウスの体液性免疫寛容の維持に重要な役割を果たします。肝臓学 59、443–452 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kubes, P. & Jenne, C. 肝臓における免疫反応。アンヌ。イミュノール牧師。 36、247–277 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ワン、ZYら。肝臓の単細胞およびバルクトランスクリプトミクスにより、線維症を伴う NASH の潜在的な標的が明らかになります。科学。議員 11、19396 (2021)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

メイン州ショールとZG フリドレンダーがん患者における腫瘍関連好中球。ナット。クリン牧師。オンコル。 16、601–620 (2019)。

論文 PubMed Google Scholar

Zilionis、R. et al. ヒトおよびマウスの肺がんの単細胞トランスクリプトミクスにより、個体および種全体で保存された骨髄集団が明らかになります。免疫 50、1317–1334.e1310 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tang, J.、Yan, Z.、Feng, Q.、Yu, L.、Wang, H. 肝疾患の発症における好中球の役割。フロント。イムノール。 12、625472 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ju, C. & Tacke, F. 恒常性と肝臓疾患における肝臓マクロファージ: 病因から新しい治療戦略まで。細胞。モル。イムノール。 13、316–327 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

中村 K.、影山 S.、JW Kupiec-Weglinski 肝移植虚血再灌流傷害における好中球の進化する役割。カー。トランスプリット議員第6号、78–89 (2019)。

論文 PubMed Google Scholar

フォーダー、M.ら。肝臓に常在する免疫細胞のレパートリー - 機械灌流中の恩恵か災難か? フロント。イムノール。 13、982018 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Scheuermann、U.ら。損傷に関連した分子パターンは、肝臓の機械保存中に炎症性損傷を誘発します。これは、有望な技術を強化する潜在的なターゲットです。肝臓移植。 25、610–626 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

カールソン、KN et al. インターロイキン 10 およびトランスフォーミング成長因子 β サイトカインは、ラット肝臓の正常温 ex vivo 機械灌流中の免疫活性化を低下させます。肝臓移植。 27、1577–1591 (2021)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

リー、ACH et al. ドナー肝臓の免疫プロファイルに対する正常温機械灌流の影響。フロント。イムノール。 13、788935 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

オーマン、A.ら。廃棄肝臓の正常温機械灌流中のオートファジーの活性化は、肝細胞機能の改善と関連しています。午前。Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．胃腸検査。肝臓生理学。 322、G21–G33 (2022)。

論文 PubMed Google Scholar

フェルディナンド、JR 他ヒト腎臓灌流中のサイトカイン吸収は、遅延した移植片機能に関連する炎症性遺伝子サインを減少させます。午前。 J. Transpl. 21、2188–2199 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

Virshup、I.、Rybakov、S.、Theis、FJ、Angerer、P. & Wolf、FA データ: 注釈付きデータ。 bioRxiv https://doi.org/10.1101/2021.12.16.473007 (2021) でプレプリント。

Wolf, FA、Angerer, P. & Theis, FJ SCANPY: 大規模な単一細胞遺伝子発現データ分析。ゲノムバイオル。 19、15 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu、C.ら。深層生成モデルを使用した単一細胞トランスクリプトームデータの確率的調和とアノテーション。モル。システム。バイオル。 17、e9620 (2021)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Gayoso, A. et al. 単一細胞のオミクスデータの確率的分析のための Python ライブラリ。ナット。バイオテクノロジー。 40、163–166 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ニュージャージー州バーンスタインほか Solo: 半教師あり深層学習による単一細胞 RNA-Seq におけるダブレットの同定。セルシステム。 11、95–101.e105 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Becht、E. et al. UMAP を使用して単一セルデータを視覚化するための次元削減。ナット。バイオテクノロジー。 37、38–44 (2018)。

記事 Google Scholar

バージニア州トラーグ、L. ウォルトマン、ニュージャージー州ファン・エックルーヴァンからライデンまで: つながりの深いコミュニティを保証します。科学。議員9、5233（2019）。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Love, MI、Huber, W. & Anders, S. DESeq2 を使用した RNA-seq データの倍数変化と分散の適度な推定。ゲノムバイオル。 15, 550 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

スクエア、JWら。単一細胞の差次的発現における誤った発見と対峙する。ナット。共通。 12, 5692 (2021)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Badia-i-Mompel、P. et al. decoupleR: オミクスデータから生物活性を推測するための計算手法の集合体。バイオインフォマ。上級 2、vbac016 (2022)。

記事 Google Scholar

Ignatiadis, N.、Klaus, B.、Zaugg, JB & Huber, W. データ駆動型の仮説重み付けにより、ゲノム規模の多重テストにおける検出力が向上します。ナット。方法 13、577–580 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ホランド、CH et al. 単一細胞 RNA-seq データに対する転写因子および経路解析ツールの堅牢性と適用性。ゲノムバイオル。 21、36 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ロビン、Ｘら。 pROC: ROC 曲線を分析および比較するための R および S+ 用のオープンソースパッケージ。 BMCバイオインフォマ。 12、77 (2011)。

記事 Google Scholar

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著者らは、技術サポートについては Astrid Drasche と Annabella Pittl、統計サポートについては DI Wolfgang Peter に感謝します。この研究は、オーストリア科学基金 FWF (助成金番号 TAI-697) (DW)、「In Memoriam Gabriel Salzner Stiftung」(SS、DW)、Tiroler Wissenschaftsfond (TH)、Jubiläumsfonds— Österreichische Nationalbank (RO)、 FFG 助成金オーストリア研究促進庁、858057 (HD FACS、S.So.)。 GS は、オーストリア科学アカデミーの DOC フェローシップによって支援されました。著者のマーゴット・フォーダー (MF) は、博士号を取得するためにこの研究の資料とデータの一部を使用します。論文。

これらの著者は同様に貢献しました: T. Hautz、S. Salcher、M. Fodor。

この作品は、D. Wolf、S. Schneeberger の著者が共同で監修しました。

オーストリア、インスブルックのインスブルック医科大学、内臓・移植・胸部外科、手術医学センター、オルガンライフ研究所およびD.スワロフスキー研究所

、T. ハウツ、M. フォーダー、S. エブナー、B. カルディーニ、J. ホフマン、T. レッシュ、F. クレンドル、A. ヴァイセンバッハー、G. オタラシヴィリ、D. オフナー、J. トロップマイヤー、R. オーバーフーバー & Sシュネーベルガー

オーストリア、インスブルックのインスブルック医科大学、インスブルック総合がんセンター (CCCI)、内科第 5 部、血液腫瘍科

サルチャー S、マイア A、トレボ M、ウンターガッサー G、ソッパー S、マルトヴィッツ A、ダウム S、カルブ M、ピルチャー A、ウルフ D

インスブルック医科大学バイオセンター、バイオインフォマティクス研究所、インスブルック、オーストリア

G. シュトゥルム & Z. トラヤノスキー

Tyrolpath Obrist Brunhuber GmbH、ザムス、オーストリア

G.ウンターガッサー、A.マルトヴィッツ、P.オブリスト

インスブルック医科大学病理学、神経病理学および分子病理学研究所、インスブルック、オーストリア

B.ゼルガー

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概念化と研究デザイン (TH、RO、AP、DW、S.Sc.)、データ収集 (MF、BC、JH、TR、FK、AW、GO、RO、AP)、sc-RNA シーケンスの実行とデータの分析 ( S.Sa.、GS、GU、A.Mai.、MT、S.So.、MK)、フローサイトメトリー分析の実行とデータの分析 (SE、MF、TH、S.So.)、Luminex の実行とデータの分析 ( MF、TH)、病理学および顕微鏡分析 (A.Mar.、PO、BZ)、視覚化 (S.Sa.、MF、GU、A.Mar.、SD、D.Ö.、ZT、JT)、原文執筆草稿（TH、S.Sa.、MF）、記事のレビューと最終編集（すべて）。 OR、PA、WD、SS は上級著者として同等に貢献しました。

D. Wolf または S. Schneeberger との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Damien Chaussabel と他の匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Hautz, T.、Salcher, S.、Fodor, M. 他。肝臓の正常温装置灌流における単一細胞 RNA シーケンスによってデコンボリューションされた免疫細胞の動態。 Nat Commun 14、2285 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-37674-8

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受信日: 2022 年 2 月 22 日

受理日: 2023 年 3 月 27 日

公開日: 2023 年 4 月 21 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37674-8

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