ナノギャップを使用した混合サンプル内の生体分子の直接識別

Scientific Reports volume 13、記事番号: 9103 (2023) この記事を引用

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単一分子の測定では、金属ナノギャップ電極が単一分子の電流を直接測定します。 この手法は、さまざまなサンプルの新しい検出方法として盛んに研究されています。 機械学習を適用して単一分子に由来するシグナルを分析し、識別精度を向上させました。 しかし、従来の同定方法には、標的分子ごとに測定すべきデータが必要なことや、ナノギャップ電極の電子構造の変化などの欠点があった。 本研究では、混合試料溶液のみで測定した単一分子測定データに基づいて分子を同定する手法を報告する。 個々のサンプルの測定データに対して分類器を学習させる必要がある従来の手法と比較して、提案手法は混合溶液の測定データから混合比を予測することに成功しました。 これは、事前のトレーニングなしで、混合溶液からのデータのみを使用して単一分子を識別できる可能性を示しています。 この方法は、化学分離法が適用できない生体サンプルの分析に特に有用であると期待されており、単一分子測定が分析手法として広く採用される可能性が高まります。

複雑なサンプルの直接測定は、サンプル前処理手順とサンプル損失を最小限に抑えて時間とコストを節約するなどの利点をもたらし、同時に広範囲の分子の検出を可能にします。 単一分子測定は、ナノ電極間の分子を直接測定するため、新たな分子検出・定量測定法として注目されている1,2,3。 単一分子電気計測法であるブレークジャンクション法4,5,6,7では、接合の破壊と形成を繰り返すことで金属ナノギャップが形成されます。 分子がナノギャップを通過するときに発生するトンネル電流を測定することで、単一分子を検出します。 単一分子の測定は、分子デバイスの開発のために活発に研究されています2,8,9,10,11,12,13。 Di Ventra のグループが DNA および RNA シークエンシングの可能性を理論的に提案して以来、単一分子測定は、その高いスループット、低い検出限界、および前処理ステップなしで測定を実行できる機能により、分析方法として大きな注目を集めてきました3,14,15。 。 これまでに、私たちのグループは DNA および RNA 核酸塩基のコンダクタンス測定を報告し、分析方法としての単一分子測定の適用可能性を実証しました 16、17、18。 標的分子は DNA や RNA に限定されず、アミノ酸 19,20、ペプチド 21,22、タンパク質 23,24,25、神経伝達物質 26、グルコース 27、NADH28 など、さまざまな分子に拡張することができます。 また、測定対象は生体分子に限定されない。 単一分子の測定には幅広い応用が期待されています。 たとえば、爆発物を検出する可能性があります29。 さまざまな分子のコンダクタンスは単一分子測定で測定できますが、単一分子のコンダクタンスは非常に変動しやすいです30、31、32、33。 したがって、信頼性の高い分子の同定には、単一分子シグナルの統計的評価が不可欠です。 最も一般的なコンダクタンス ヒストグラム ベースの分析では、単一分子コンダクタンスに関する統計的なコンダクタンス情報のみが得られます。 コンダクタンス ヒストグラムが重なると、単一分子の識別精度が低くなります。 単一分子測定への機械学習の適用は、これらの問題に対処する有望な方法です。 機械学習ベースの分析により、単一分子測定の識別精度が向上しました26、34、35、36、37、38。 しかし、従来の機械学習アプローチでは、ターゲット分子ごとに 1 つの化学種のみを含む溶液から取得したトレーニング データが必要です。 生体分子や特定の標的を検出するための単一分子測定の応用を考慮すると、すべての分子の不純物を含む溶液から 1 つのサンプルのみを含むリファレンスを調製することが困難な場合があります。 ただし、不純な溶液中でターゲット分子の濃度が異なるサンプルを調製することは比較的簡単です。 たとえば、生物学的サンプル中のターゲットの発光を促進または抑制したり、サンプル溶液に参照分子を追加したりすることによって。 特定の標的分子のみを含む溶液を測定できたとしても、教師データとサンプルの測定環境が異なる場合があるため、教師データを使用して構築された機械学習分類器がそのサンプルに適用できない場合があります。 これらの理由から、単一種の標的サンプルを使用せずに混合サンプルから直接識別する方法の開発は、単一分子測定の分野における大きな進歩を意味します。 このアプローチは、複雑なサンプル中の生体分子やその他のターゲットの検出に関する洞察を提供する上で、大きな可能性を秘めています。 ここで、本研究の目的は、混合溶液のみに基づいて分子を同定する分析法の開発であった。 図1に示すように、既に純溶液1分子測定や従来の機械学習による解析で同定可能であることが知られているdGMPとdTMPを対象として、それらの混合物のみから混合溶液の濃度比を求める手法を開発しました。

単一分子分類のフローチャート。 単一分子電流測定では、サンプル溶液をPDMSウェルに注入し、圧電デバイスを備えた微調整されたプッシュバーでチップを曲げてナノギャップを形成し、その後電流を測定しました。 緑色のボックスは従来の手法を表し、オレンジ色のボックスは新しいコンセプトを表します。 実線は個々のサンプルのプロセスを示し、破線は混合物のプロセスを示します。

この研究の標的分子は、デオキシグアノシン一リン酸 (dGMP) とチミジン一リン酸 (dTMP) の 2 つの DNA ヌクレオチドです。 これらのターゲットは、2 つの分子の混合物の識別における適用性ではなく、機械学習を使用した単一分子シグナル識別のモデル システムとして選択されました。 ヌクレオチドは単一分子の測定によって同定でき、これまでにさまざまな研究で標的分子として報告されています 15、17、36。 図 2a、b はそれぞれ dGMP と dTMP の分子構造を示しています。 図2c、dに示すように、個々の分子がナノギャップを通過するときに電流パルス信号が生成されます。 図 2c、d は、最大電流 (Ip) 値のヒストグラムを示しています。 dGMP と dTMP の平均電流は、100 mV のバイアス電圧下でそれぞれ 32 pA と 25 pA です。 dGMP は、その HOMO 準位が dTMP よりも dGMP の伝導軌道である Au フェルミ準位 39 に近いため、dTMP よりも高いコンダクタンスを示します。 2 つの分子の平均コンダクタンスは明らかな違いを示していますが、それらの Ip ヒストグラムは重複を示しています。 どちらのヒストグラムも 20 pA で低電流信号を示しています。 低電流信号は、ナノギャップ間の単一分子架橋構造によって引き起こされました。 リボース糖の低分子軌道を介した電子輸送により、電流が低下します40。 重複が大きい​​ことは、Ip に依存するヒストグラムに基づく分析手法のみに依存すると正確な識別には不十分であり、機械学習の使用が必要であることを示しています。

dGMP および dTMP 単一分子測定の結果。 (a)、(b) それぞれ dGMP と dTMP の分子構造。 (c)、(d) dGMP および dTMP の 3 つの個別の電流パルス。 (e)、(f) それぞれ dGMP と dTMP の最大電流 (Ip) のヒストグラム。 各電流は 100 mV のバイアス下で測定されます。

提案手法との比較として、従来の機械学習による分類手法を用いて混合物の混合比率を予測した。 従来の手法では、まず、分子名のラベルを付けた各単一標的溶液の測定から得られる単一分子電流信号から機械学習分類器を学習させます。 次に、機械学習分類器は、各分子シグナルの学習された特性に基づいて、混合物から得られた現在のシグナルを識別します。 最後に、混合溶液データの予測された各分子ラベルをカウントし、各分子のシグナル数の比として濃度比を求めます。 図 3a は、機械学習分類器トレーニングの検証プロセスを示しています。 機械学習の検証プロセスは、機械的に制御可能なブレークジャンクション (MCBJ) の測定、信号抽出、特徴抽出、トレーニング、および識別で構成されます。 この研究では、以前に報告された方法で使用された、Ip、継続時間（td）、および10次元の正規化電流係数からなる13次元ベクトルを特徴として使用します20、26、35、36。 10次​​元の正規化電流係数は、図3bに示すように、10時間の各セクションの最大電流値で正規化された平均電流値として定義されます。 補足情報の図S1に示すように、検証、トレーニング、予測には10分割交差検証（CV）方法が使用されました。 10 倍 CV では、すべてのデータが 10 のサブセットに分割され、1 つのサブセットがテスト データとして使用されますが、識別は 10 回のループで他のサブセットによってトレーニングされ、すべてのデータが 1 回テストされるようになります。 純粋な溶液中で測定された 2 つの分子の検証結果は、図 3c に示す混同行列に示されています。 分類のパフォーマンス指標である F 値は 0.78 です。 このアプローチは、単一の化学種のみを含む溶液から測定されたデータに基づいてトレーニングされた機械学習分類器の識別可能性を実証します。 分類器の識別能力を確認するために、前ステップで各分子の現在の信号を学習した機械学習分類器を使用して、ターゲットの混合比率を予測しました。 図 4a、b は、それぞれ dGMP:dTMP = 3:1 および dGMP:dTMP = 1:3 の 2 つの混合物で測定された Ip のヒストグラムを示しています。 導電性の高い dGMP を多く含む dGMP:dTMP = 3:1 溶液は、導電性の低い dTMP を多く含む dGMP:dTMP = 1:3 溶液よりも高いコンダクタンスを示します。 図4cは、混合比を予測するために前のステップで各ターゲットの電流信号から訓練された機械学習分類器を使用して、混合で得られた電流信号を識別するプロセスを示しています。 このプロセスを使用して、機械学習分類器は、図に示すように、dGMP:dTMP = 3:1 および dGMP:dTMP = 1:3 ソリューションから得られた信号の混合比がそれぞれ 1.7:1 および 1:1.6 であると予測しました。 4d。 図3cに示すように、各ヌクレオチドの識別精度は個別に異なるため、豊富なヌクレオチドの予測率が過小評価される可能性があります。

従来の機械学習の学習方法と識別結果。 (a) 従来の手法を用いた純粋解に対する機械学習の学習プロセス。 特徴には、各パルス信号のピーク電流 (Ip)、持続時間 (td)、平均電流 (Iavg.)、10 次元正規化電流などの要素が含まれます。 (b) 単一分子の個別電流パルス (青色の実線) とその特徴の定義。 黒い破線は、時間軸に沿って 10 個の部分に分割された電流パルスの領域を示します。 I1～I10に分けた各部分の平均電流値（赤破線）は、それぞれ13.2、38.3、38.0、43.5、35.4、44.1、42.0、34.3、39.0、30.8pAとなった。 Si は、Ip に関して正規化された Ii を意味します。 緑、赤、ピンクの実線はそれぞれ Ip、td、Iavg. を表します。 (c) 純粋な溶液における dGMP および dTMP 予測の混同行列。

前のステップで分子の現在の信号に基づいてトレーニングされた分類器を使用して、ターゲットの混合比を予測するプロセスと結果。 (a)、(b) 2 つの混合物、それぞれ dGMP:dTMP = 3:1 および dGMP:dTMP = 1:3 で測定された Ip ヒストグラム。 (c) 各ターゲットの現在の信号でトレーニングされた機械学習分類器を使用して混合物の現在の信号を識別し、混合比を予測するプロセス。 (d) 学習済みデータに基づいて混合物の混合比を予測した結果。

この研究の主な目的は、混合溶液のみを使用して測定されたデータから 2 つの分子を区別する方法を開発することです。 2 つの混合物、つまり dGMP または dTMP をより多く含む溶液の濃度間の関係は既知です。 この新しい概念の測定および識別プロセスを図 5a に示します。 2 つの分子の識別境界は、非標識データとカーネル密度推定 (KDE) に基づく非標識データ分類 (UUC) を使用して 2 つの混合物から得られたデータから直接推定されました 41。 図5bは、2つのクラスが異なる濃度で混合されたデータから判別境界を決定する方法であるUUCの概念図を示しています。 図 5b では、青と赤の色が 2 種類の混合物を表しています。 どちらの溶液にも、異なる濃度の 2 つのクラスが含まれています。 クラスは事前に不明です。 UUC の目的は、ソリューション内にどちらのクラスがより多く存在するかに基づいて、これら 2 つのクラスを区別することです。 KDE は、図 5c に示すように、観測データから直接特徴空間内の確率密度関数を推定するために使用されるノンパラメトリック統計手法です。 KDE は、データ ポイントを追加してヒストグラムを作成する方法と同様に、観測された各データ ポイントから取得したガウス カーネルを追加して確率密度を直感的に計算します。 この方法はヒストグラムに比べて少ないデータで滑らかな確率密度分布を得ることができます。 この研究では、ガウス カーネルは観察されたデータ ポイントを中心に配置されました。 この研究で使用された UUC 法では、2 つのクラスの確率密度分布は、KDE ​​によって補正を通じて決定されました。 この方法は、データ ポイントの 1 つに正のクラスのみが含まれる状況に対して提案されます。 ただし、提案された方法は、より高い濃度の領域がより高い確率密度を示すという原理に基づいているため、既知の濃度関係を持つ 2 つのラベルなしデータ混合にも適用できます。 従来手法との比較のため、前節で説明したのと同じデータセットから抽出した同じ特徴量を用いて同定を行った。 UUC 機械学習分類器は、混合物からの信号のみを使用してトレーニングされ、分子を予測しました。結果は図 5d に示されています。 dGMP:dTMP の 3:1 および 1:3 の比率に対応するシグナルの比率は、それぞれ 3.2:1 および 1:3.5 であると予測されました。 図5eに示すように、この研究で提案した新しい識別方法の性能を従来の方法の性能と比較します。 電極の電子構造は、単一分子のコンダクタンスに影響を与えます。 電極表面への分子吸着や電極の形状の違いによる電子構造の変化は、単一分子信号に影響を与える可能性があります42、43、44、45。 近年、さまざまな機械学習手法が開発されています。 教師なし学習は、教師あり学習と同様に、明示的なラベルのないデータの識別に適用できます。 この方法は、単一分子測定の I-z トレースの識別に適用されています 34。 ただし、SI.5 に示すように、従来の教師なし学習方法では、2 つのソリューションからの実験データを適切に識別できません。 新しい UUC 法は、混合物のみを測定することで 2 つの分子を識別できます。 この手法により、環境変化による誤差の伝播が防止され、従来手法よりも高精度な識別が可能となると考えられる。 図 5f は、dGMP:dTMP = 3:1 溶液の電流プロファイルと UUC 法によって得られた分子予測結果を示しています。 赤と青のシグナルは、それぞれ dGMP 由来のシグナルと dTMP 由来のシグナルを示します。 混合物から得られるシグナルは個別に識別できます。

(a) 混合物のみからのデータを使用してトレーニングおよび識別するプロセス。 (b) UUC の概略図。 赤と青の色は、2 つのクラスの濃度が異なる 2 種類の混合物を表します。 丸と三角は各クラスを表します。 UUC メソッドは、2 つのクラス間の境界を表すオレンジ色の曲線を決定します。 (c) 特徴空間内の確率密度関数を推定するための KDE の概略図。 赤と青の点と破線は、それぞれデータ ポイントとそのガウス カーネルを示します。 実線の曲線は破線の合計を表し、カーネル密度の推定値を表します。 (d) 混合物のみについて学習されたデータを使用して 2 つの混合物の混合比を予測した結果。 (e) 予測率に関する新旧手法の性能比較。 (f) 各単一分子のシグナルを個別に識別した結果得られる電流プロファイル (dGMP:dTMP = 3:1 溶液中)。 (g)、(h) それぞれ dGMP:dTMP = 3:1 および dGMP:dTMP = 1:3 ソリューションの同定結果に基づく Ip ヒストグラム。 赤と青のバーは、それぞれ dGMP と dTMP として予測されたヒストグラムを表します。 実線は 2 つのヒストグラムの合計を表します。

前のセクションでは、個々のヌクレオチドのコンダクタンス ヒストグラム (図 2) から、dGMP のコンダクタンスがより高いことが示されました。 識別された個々の信号に焦点を当てると、dGMP 信号は常に dTMP 信号よりも高いコンダクタンスを示すわけではありません。 機械学習アルゴリズムは、コンダクタンスと信号形状の両方に基づいて信号を区別できます。 これは、識別結果の現在のヒストグラムが統計的に分析されているためです。 dGMP:dTMP = 3:1およびdGMP:dTMP = 1:3溶液から得られたシグナルの識別結果のIpヒストグラムをそれぞれ図5g、hに示します。 赤と青のバーは、それぞれ dGMP と dTMP として予測されたヒストグラムを表します。 ヒストグラムは、UUC 法が混合比を予測できること、および dGMP が dTMP よりも高いコンダクタンスを持っていることを確認します。 これは純溶液測定の結果と一致します。 特に、この新しい方法では、濃度が未知の 2 つの混合溶液のみを使用して濃度比を決定することができます。 この技術は分子検出法への応用が期待されている。 たとえば、この技術は、正常なサンプルと、目的の分子を促進または抑制するコントロールを含む陽性/陰性サンプルと比較することによって、または目的の分子を含む生体サンプル中の分子の濃度比を決定するために適用できます。未知の濃度のサンプルおよび参照サンプルが添加されたサンプル中の目的の分子の濃度を測定する。 目的の分子の濃度比は、目的の分子を促進または阻害するコントロールを使用して、目的の分子の陽性/陰性サンプルから決定することもできます。

本研究では、混合溶液のみの単一分子測定を用いた分子同定手法と、カーネル密度推定を用いた2種類の非標識データの識別手法を開発した。 従来の方法と比較して、私たちのアプローチは混合溶液の組成を予測する精度が向上していることがわかりました。 今回開発した、サンプルを個別にトレーニングすることなく、混合溶液中の標的分子を同定する技術は、単一分子測定分野においてさまざまな分子への幅広い応用が期待されます。

デオキシグアノシン一リン酸 (dGMP、Sigma-Aldrich) とデオキシチミジン一リン酸 (dGTP、Sigma-Aldrich) を、さらなる精製プロセスを行わずに Milli-Q 水で希釈しました。 測定に用いたdGMPおよびdTMPの各溶液の濃度は10μMであった。 dGMP:dTMP = 3:1 の測定には 750 μM dGMP と 250 μM dTMP の混合物を使用し、dGMP:dTMP = 1:3 の測定には 250 μM dGMP と 750 μM dTMP の溶液を使用しました。 ポリジメチルシロキサン (PDMS) ウェルを作製し、酸素プラズマで 10 秒間処理し、MCBJ ナノギャップ電極デバイスに取り付け、90 °C の真空オーブンで 60 分間処理しました。

MCBJ 技術を適用して金ナノギャップを形成しました。 金ワイヤはフレキシブルシリコン基板上に蒸着されました。 まず、シリコン基板上に絶縁層としてポリイミド薄膜を形成した。 電子ビームリソグラフィーを使用して数十ナノメートル幅のパターンが作製され、プラズマ化学気相成長法を使用して金ワイヤがパターン上に堆積されました。 最後に、ポリイミド層をドライエッチングして金ワイヤブリッジを形成しました。 金ワイヤ基板を MCBJ システムに設置し、三点曲げによる繰り返しの曲げによりワイヤが機械的に断線し、急激な電流降下が現れるまで、電流変化を監視しました。 このプロセス中、圧電デバイスを使用して電流が測定され、ギャップ幅をリアルタイムで正確に制御し、圧電調整されたプッシュロッドを微調整しました。

溶液は、MCBJ デバイスに取り付けられた PDMS ウェルに注入されました。 １００ｍＶの電圧を溶液電極に５分間印加した。 個々の測定の前に、Milli-Q 水のみを注入して対照実験を実行しました。 ナノギャップの電極間距離 d は MCBJ 法により 0.58、0.56、0.54 nm に固定しました。

830 個のパルス信号のそれぞれは、scikit-learn バージョン 0.24.246 のランダム フォレスト (RF) 分類器の教師あり機械学習を使用してトレーニングおよび分類されました。 検証プロセスでは、10 倍 CV が実行され、その平均値と標準偏差値が分類率と誤差を提供しました。 誤差は10回の分類の標準偏差です。 混合溶液分析では、RF 教師あり機械学習分類器が、それぞれ 1000 個の dGMP 信号と dTMP 信号でトレーニングされました。 Ip > 20 pA および td > 1 ms のシグナルが分析されました。 混合物からの信号は、トレーニングされた分類器を使用して 1 つずつ分類されました。 分析は Python 3.10.4 を使用して実行されました。 UUC および重み付けされた KDE ソース コードは、Python 3.10.4 を使用して独自に準備されました。 混合物からの 1000 個のシグナルと特徴は従来の方法と同じです。 ガウシアンカーネルを採用しました。 帯域幅はシルバーマンの法則41によって決まります。

この研究の結果を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。 通信および資料のリクエストは MT に宛ててください。

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本研究は、日本学術振興会（JSPS）科研費19H00852、21H01741、22K14566、独立行政法人科学技術振興機構（JST）進化科学技術基盤研究（CREST）助成金JPMJCR1666、JST開拓支援の助成を受けて行われました。 Research Initiated by the Next Generation (SPRING) 助成番号 JPMJSP2138、日本。 英語の編集については Editage (www.editage.com) に感謝します。

SANKEN, Osaka University, 8-1 Mihogaoka, Ibaraki, Osaka, 567-0047, Japan

Jiho Ryu, Yuki Komoto, Takahito Ohshiro & Masateru Taniguchi

大阪大学人工知能研究センター（〒567-0047 大阪府茨木市）

Yuki Komoto

大阪大学オープン・融合研究機構（OTRI）医科学統合フロンティア研究部門（〒567-0047 大阪府茨木市）

Yuki Komoto

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JR、YK、TO、MT が実験を計画、設計しました。 JR、YK、TO は MCBJ の作製と単一分子の電気測定に参加しました。 JRとYKがデータ分析を実施した。 JR、YK、TO、MT がこの論文を共同執筆しました。

Correspondence to Masateru Taniguchi.

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Ryu, J.、Komoto, Y.、大城, T. et al. ナノギャップベースの単一分子電気測定を使用して、混合サンプル内の生体分子を直接識別します。 Sci Rep 13、9103 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-35724-1

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受信日: 2023 年 3 月 27 日

受理日: 2023 年 5 月 23 日

公開日: 2023 年 6 月 5 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35724-1

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